N01

核酸的構造與性質

核酸也是先把構造說明清楚後，才能對其性質有所瞭解。

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N02

基本的分子構造

核酸是細胞內的巨分子之一種，分成 DNA (去氧核糖核酸) 及 RNA (核糖核酸) 兩大類，是由核苷酸的小單位分子所組成。同樣的，核酸也是先說明其分子構造後，再以構造為基礎，來認識其種種生理性質。

學習核酸的構造，首要清楚辨別巨分子的核酸，是如何以單位小分子連接起來，兩條 DNA 分子如何配接起來成為雙螺旋鏈。這幾乎是所有生命現象的核心，在五十年前 Watson 及 Crick 發現雙螺旋的構造，同時也開啟了分子生物學的蓬勃研究。目前我們只能簡短說明核酸的構造與一般性質，至於圍繞著 Central Dogma 所發生的種種分子遺傳學知識，只能留待下學期講述。 雖然如此，我們還是儘量把基因操作的一些基本原理及方法，做一個簡單而概念性的說明。

希望同學們在這段課程內打下良好的基礎，以便在未來面對種種複雜的分子生物學問題時，能夠清楚地對付之。

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N03

象形文字

核苷酸 這三個字有點像象形文字。因為它剛好指出了 nucleotide 單位分子中的三個主要部分： 鹼基、五碳糖、磷酸。 當核苷酸去掉磷酸時，中文直接變成 核苷，英文則為 nucleoside。

講義上 (圖 1) 有核苷酸的分子構造，請仔細辨別各種構造上的差異，以及其所造成的影響。

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N04

Nucleotide 單位以雙磷酯鍵連結

兩個核苷酸之間，前一個 (1) 以 3'-OH 與次一個 (2) 的 5'-磷酸，進行連結形成 磷酸二酯鍵 (phosphodiester bond)。 如此一直接下去，就成為核酸的長鏈。但最後有一個磷酸及一個 -OH 基是不被修飾的，因此核酸的長鏈具有方向性，可以寫成 5'-P → 3'-OH 兩端，就像蛋白質有 N-端及 C-端一樣。

又如同蛋白質的 N-C-C-N-C-C-N-C 骨架，核酸長鏈也有分子脊骨，它是以磷酸-核糖輪流出現的 P-R-P-R-P-R  骨架，同時在核糖分子上一個一個加上各種鹼基，組成種種序列。

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N05

核酸長鏈的寫法：有方向性

核酸長鏈的記錄法，當然不能每次都把整個構造寫出來。方便的筆記法是把核糖變成一直線 (R)，從上到下分別是 1' → 5'，而 1' 接有鹼基 (B)，5' 接磷酸 (P)；各核苷酸間以斜線表示磷酸二酯鍵。

後來覺得這樣還是很麻煩，就省去直線及斜線，以 p 代替雙磷酯鍵，只留下各個不同的鹼基序列，最後又去掉鹼基間的 p；有時特別標出 5' 及 3' 端作為提醒，因為核酸的方向性極為重要。

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N06

兩股核酸的方向相反

兩條 DNA 核酸配對在一起時，其 5'-3' 方向剛好相反；這兩股 DNA 互相捲繞成為有名的雙螺旋構造。 這種方向性，對核酸的複製及轉錄很重要，因為這些活動都有一定的方向。

A＝T 與 C≡G 間是以氫鍵連結，其立體的分子構造，在很多書上都有。 雙螺旋分子有點像扭曲的樓梯，而 A＝T 與 C≡G 就是水平的踏板，一階一階排列在兩條磷酸脊骨之間。

雙螺旋是由 Watson 及 Crick 在劍橋大學發現的，他們根據所收集的研究資料，即推出 DNA 的雙螺旋構造。這些資料如下：

(1) DNA 是遺傳物質，其所含鹼基當中，A 的含量等於 T，C 等於 G。

(2) 由X光繞射分析結果得知，DNA 是螺旋狀，含有兩條磷酸脊骨；並且得知許多有關 DNA 分子空間排列的數據。

(3) A 與 T 之間可以用兩個氫鍵結合，C 與 G 之間有三個氫鍵。

整個發現過程充滿戲劇性，Watson 把它寫成偵探小說般的 The Double Helix，出版後雖然爭議不斷，但也可描繪出這個世紀大發現的過程。

Watson 與 Crick 所發現的雙螺旋，是稱為 B 型的水結合型 DNA，在細胞中最為常見；另外也有 A 型及 Z 型兩種，Z 型 DNA 最早只是實驗室中的人工產物。

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N07

10.5 bp 組成一個重複單位有 3.6 nm 長

雙螺旋 是一條雙股重複扭曲的螺旋鏈，其重複出現的扭曲單位如上圖所示；以常見的 B 型 DNA 而言，每 10.5 bp 形成一個扭曲單位，長度有 3.6 nm (上圖 34A 須更正為 36A)；注意每一個扭曲單位中，DNA 的一股會交過另一股一次。因為分子的扭曲並非對稱，因此分子表面會形成大小凹谷，這些凹谷對核酸與蛋白質的相互作用關係，有很大的貢獻。

同時因為磷酸脊骨露在外面，因此核酸的外側有相當大的負電聚集；若把 DNA 溶在純水裡，則兩股磷酸脊骨會互相排斥，造成 DNA 的兩股分開而變性沈澱，故 DNA 都要溶在含有離子的溶液中 (TE buffer)。

在細胞中，DNA 更會捲繞在帶有強正電的蛋白質上 (如 histone)，除了抵消負電性外，還有利於 DNA 的包裝，以便容納在細胞核中。這種包裝方式，在真核細胞的染色體中，有極為複雜的組織方式。

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N08

L = T + W (supercoiling 的數目)

雙螺旋 的磷酸脊骨，雖然比起蛋白質長鏈有較大的彈性，可以較為自由地活動，但仍有一定的限制。 因此，整條雙螺旋分子並不能很自由地平攤成一直線，會以雙螺旋為軸心再度捲繞，稱為 超捲曲 (supercoil) 的構造。有點像把兩股橡皮筋以雙螺旋纏繞在一起，若把纏繞的密度加大，這條雙股橡皮筋會再度捲繞起來，成為超捲曲。超捲曲的數目 (W)，與其所含鹼基數目及扭曲數目 (T) 有關，可以 L = T + W 表示之；請見講義的例子。

若核酸的序列為一級構造，則雙螺旋為二級構造，超捲曲則是其三級構造。

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N09

Palindrome, Restriction Enzymes

核酸的構成序列中，有一種特殊的短鹼基序列，其鹼基的排列是前後互補 (如 GAATTC)，稱之為 palindrome；此字是文學上的用字，文句可以自由由前面向後念，或由後面向前面念者稱之 (如 madam)。

有一大類酵素，可以辨認核酸序列上的這種特殊構造，並且予以水解，統稱為限制脢 (restriction enzyme)；這是因為含有某種限制脢的大腸菌，會限制某些入侵的病毒攻擊。

因為 palindrome 的核酸序列是對稱的，所組成的 DNA 構形會在長條雙螺旋上造成一個對稱的小轉折，限制脢即可認識這種對稱的轉折，並且結合到該處，再以非 Watson-Crick 的鍵結方式，在雙螺旋分子的外側凹谷 (grooves)，探索其所含鹼基序列，看是否為其所能水解者。

較長的 palindrome 序列可以形成同一股 DNA 分子內的鹼基配對，因而形成十字形 (cruciform) 構造，兩者之間也可以互相變換；可能作為 DNA 分子上的標記位置，以便在 DNA 分子上進行各種反應。

● EcoRI site (GAATTC) 可生成 sticky ends (N10 動畫)    

● EcoRV site (GATATC) 可生成 blunt ends (N11 動畫)    

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N12

質體可以在宿主細菌間進出

質體是一種小型環狀 DNA，可以進出宿主細菌。 質體上面帶有可以表現出來的遺傳信息，最有名的是產生抗藥性的質體，它所轉譯出來的酵素會水解抗生素。

質體可以由一種宿主傳到另一種宿主菌，因此抗藥性也可以因此傳播開來，使得很多細菌很快對抗生素產生抗藥性。 遺傳工程也是利用質體的這種傳播功能，把一個被修改過的重組質體，放到宿主細菌中去表現，生產我們所要的物質。

◆ 相關的最新技術請連結到『生物技術簡介』(基因操作)

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N13

質體可接受外來的基因

質體用限制脢切開後，可以插入各種外來的 DNA，形成重組質體，後者可以轉形到宿主細胞中。 但是，一個細菌只能接受一種重組質體 (one plamid, one transformed cell)，而這個轉進去宿主的質體，可以在細菌中大量複製相同的質體。

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N14

分子群殖 (molecular cloning)

質體在細菌中會大量複製，大約每一隻細菌可累積 5~200 個質體 (以 100 計算)；若把這些轉形菌塗佈在培養皿上，則由單一細菌所形成的菌落，將只含一種轉形菌，也就是只含有一種重組質體。

每一個菌落若有 1000 隻細菌，而每隻細菌含有 100 個重組質體，則每個菌落就有 1×100×1000 個均質的純系重組質體，沒有雜夾其他的質體；因為一個細菌只能包容一種質體，而一個菌落只有一種細菌。

因此這種 分子群殖 (molecular cloning) 手法，有點像在『種植分子』，把一個目標基因，經過上述的 純化 與 放大 的過程，得到數目眾多的複製 DNA，可以抽取出來應用。

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N15

Central Dogma

Central Dogma 是生物界中心的基本運作法則，而其主角就是核酸，包括 DNA 及 RNA。 Central dogma 說明了遺傳信息由 DNA 流到 RNA 再到蛋白質的過程； 而其之所以能夠運作，與核酸的分子構造方式，有極大的關係。

DNA 的雙股構造，不但能夠說明其複製的機制，也使其信息更能妥善保存；同時也能夠複製成各種 RNA，以便行使轉譯蛋白質的功能。這一切流程，都設計得極為巧妙，而且有效。

RNA 雖然也是核酸，但其構造與 DNA 有很大的不同，以致於其生理功能也有相當的差異。 RNA 與 DNA 最大的不同點，在於 RNA 是單股分子，而且分子也比 DNA 小；因此，RNA 是從長條的 DNA 分子所拷貝下來的一小段功能單位，也帶有 DNA 上的密碼指令，並依此指令行事。主要的 RNA 有三大類，是為 mRNA, tRNA, rRNA 等，每個都與蛋白質的合成有關。

● 連結到 Central Dogma 的動畫。

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N16

生物技術學程的實驗課程 BCT

本校生物技術學程所開的第二階課程，都是以 Central Dogma 為對象，分別有一門講習課 (分子生物學)，及一門實習課 (生物技術核心實驗 BCT)。 講習課以 Gene VII 為課本，詳細說明分子生物學上的種種活動；實習課則以 gus 基因為對象，從 DNA 純化開始，經群殖及篩選後，檢定其所生成的 RNA，並分離純化所合成的 GUS 蛋白質。

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N17

有一面模板即可大量複製

DNA 其中的一股好像是一個模板，打開這個模板後，就可以大量複製出互補的形狀出來。 而這個模板平時不用時，還會有一個與其互補的蓋子保護，以免模板損壞。

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N18

模板為 template (-) 股，而 non-template (+) 那股 DNA 稱為 coding strand (2001/11/17 修正)

兩股 DNA 中，只有一股能轉錄出 RNA，稱為 template strand 或 (-) strand；另一股則稱 nontemplate strand, (+) strand 或 coding strand。兩股上的核酸片段，都有可能成為 template，決定在於其 3' 端上游是否有轉錄起始信號。

RNA 的轉錄合成，一定是從 RNA 的 5'  端向 3' 端複製，而模板 DNA 則是由 DNA 的 3' 向 5' 方向讀取密碼。這些方向性一定要清楚瞭解，並且牢牢記住，因為分子生物學將由這些反應開始。

同時，我們一般所知的遺傳密碼 (codon)，是根據所合成出來的 mRNA 來寫的；也就是說，mRNA 上面的序列就是遺傳密碼。而 mRNA 的序列是與 nontemplate (+) 相同的，而與 template (-) 互補。

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N19

每股 DNA 都有可能成為 template

雖然只有一股 DNA 是 template，但是兩股 DNA 的任何一股都有可能成為 template，甚至可能互相重疊。 但同一條 DNA 上的所有 templates，其閱讀方向都一樣，RNA 都由 5' 端向 3' 端複製。

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N20

Antisense RNA 與原 RNA 互補

雖然只有 template strand 可以轉譯出 RNA，但也可以用人工的手法，把 nontemplate strand 選殖出來，並且送入細胞中表現。 則所轉錄出來的 antisense RNA，將會與正常的 mRNA 互補，形成 RNA/RNA 雜合分子，因而抑制了該基因的表現。

◆ 相關的最新技術請連結到『生物技術簡介』(反義基因)

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N21

Intron 與 exon

真核細胞 的基因構造有一點與原核細胞差別很大，就是其基因當中，插入有將來不會被表現出來的片段，稱為 intron。 當轉錄 RNA 時，這些 intron 也會如數被合成出來，形成初生 RNA，後者先經 capping 及 polyA tail 的頭尾修飾後，再以 spliceosome 切出 intron，得到成熟 mRNA，送出細胞核，以便在細胞質中轉譯蛋白質。

目前還不確知為何有 intron 的存在，但若以遺傳工程手法去除 intron，則此基因可能無法正常在原來的細胞核中表現。我們將以 hemoglobin 基因為例，說明 exon 與其表現蛋白質的關係。

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N22

cDNA 做法

成熟的 mRNA 是去除 intron 的全段基因，含有完整的基因信息；因此若以 mRNA 為模板，經逆向轉錄反應所得的 DNA，稱之為互補 DNA (cDNA)。 cDNA 可以群殖入載體，並且大量表現之；以全部 mRNA 所得的 cDNA 庫，含有所有正在表現中的基因。 cDNA 選殖株可以表現出蛋白質，因此可以用抗體篩選之。

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N23

兩種基因庫

基因庫 的建構依基因來源的不同而有兩種方法，其一是上述由 mRNA 所得的 cDNA 來建庫 (上圖左)，另一則由染色體 DNA 的限制脢片段來建庫 (上圖右)。兩者在基因庫大小與其用途上，有相當的差別，要依使用目的如何而做適當選擇。

許多常用的生物或細胞 (水稻)，都有已經建立好的基因庫出售，只要買回來篩選，即可得到所要的基因。當然，自己必須準備好適當的探針。

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N24

核酸的功能性質

DNA 的性質當然與其雙螺旋構造有關，當雙螺旋鏈解開之後，即為 DNA 分子的變性；但 DNA 分子很容易復性，回復原來的雙螺旋構造；在這一開一合之間，若加入其他的核酸分子，即可做 雜合反應 hybridization，可以檢定兩種核酸分子的序列是否相似。鹼基的組成與序列，幾乎決定了核酸分子的所有命運，因此核酸定序才成為如此重要的技術。

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N25

也參加其它的重要生理功能

除了作為遺傳信息的傳遞外，核苷酸小分子也在很多的生理功能上，扮演重要角色，而且其影響範圍非常廣泛。 上面所提示的三種功能，都是所有生物都具有的基本功能，顯示核苷酸涉入演化的時間非常久遠，更加強了核酸可能在早期地球演化過程中，是最早具有演化及複製功能的巨分子。 另外，腺嘌呤 (adenine) 一直活躍地參與這些生理功能 (ATP, cAMP, NAD⁺)，暗示腺嘌呤在早期分子演化上的主角地位。

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N26

復性可在不同的單股核酸間進行

核酸變性之後，可以再黏合復性，回復原來的雙股核酸。若把兩種核酸經變性後混合在一起，假如兩種核酸的序列同質性高，則可能會雜合成為混成的雙股核酸。

也可以使用已知序列的核酸小片段，作為探針 (probe) 與 DNA 雜合；一般都先把樣本 DNA 經電泳分離後，轉印至尼龍膜上，再以放射線探針進行雜合，稱之為 Southern hybridization。 RNA 也可以在電泳後，與其互補的 DNA 序列雜合，則稱為 Northern hybridization。

探針的來源有很多，講義的 圖 2 舉出一個例子，說明如何由已知蛋白質的胺基酸序列回推核苷酸序列，並依此序列進行人工合成探針。

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N27

PCR 聚合脢連鎖反應

PCR 技術剛被 Kary B. Mullis 發展出來的時候，居然不受重視，後來發現越來越多的重要應用；不但在研究上有貢獻，在分子診斷與法醫學上更是大放異彩，也得到 1993 諾貝爾化學獎。

◆ 相關的最新技術請連結到『生物技術簡介』(PCR 基因放大)

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N28

一直重複下去可複製大量目標片段

PCR 是聚合脢連鎖反應的縮寫，可以把指定的基因片段數量放大。 但必須知道目標基因的起始及終結的部分序列，以便分別製得界定起點與終點的兩個引子。如此，聚合脢便會在兩個引子之間複製 DNA，所得到的複製品，可在變性後再度黏合引子，進行次番複製；如此重複多次，即可得到大量介於兩個引子之間的核酸片段。

● 連結到 PCR 的說明動畫。

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N29

雙去氧核苷酸 ddNTP

核酸定序方法的精髓，在於如何製得一系列的核酸片段，這些片段各中止於不同的鹼基。 講義的 圖 3 說明這些定序方法的原理，有兩種方法可以製備一系列長度的核酸片段。

目前都用 Sanger 的生合成法，以目標核酸為模板，加入四種核苷酸及 polymerase，複製該段核酸；但除了所加的四種核苷酸中，額外加入某一種核苷酸的衍生物 (dideoxynucleotide)，則合成反應將可能止於這種核苷酸的位置，因而得到各種長短不同的片段，以電泳可以依序排列出來。

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N30

核酸研究技術

核酸的研究技術，大多已散佈在上述構造與性質的說明中，因此只補充說明未提及的部分。

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N31

定點突變 site-directed mutagenesis

定點突變 是使用人工合成的引子，先與目標基因雜合 (2)，而此引子的核苷酸序列與目標基因互補，但其上有一個核苷酸變異 (GTC→GCC)。然後補滿雙股核酸 (3)，再把此混成基因轉殖進入宿主，則宿主菌的複製系統將會因複製而產生兩種質體 (4)，其一為原來的野生型，轉譯可得原來的蛋白質 (5)；另一則為突變型，轉譯則得到突變的蛋白質，但只改變了一個指定位置的胺基酸 (6)。

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