X0

     

  酵素化學實驗  X 實驗單元  

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X0  實驗進行通則

 

   

        

共有六個實驗單元 (X1-X6),每個單元是一種純化或檢定操作,每次所得到的產物,要收集並進行各種分析 (Y1-Y6); 各單元的進行,都遵循以下通則進行,請仔細閱讀:

 

流程圖

  

實驗操作前 - 做好預習準備:

 

 

1. 詳細研究每單元的操作指示與流程 (見以下 X1 至 X6),研讀各種參考講義 (如 B3) 或參考附件;充分的預習,是實驗成功的必要條件;教師將嚴格檢查預習記錄本。

 

2. 擬定你自己的實驗操作步驟流程,預習每一操作細節,有不懂的一定要問清楚。此操作流程類似大一普化實驗的工作記錄紙,預先把將要記錄的空格畫出來。 可以參照 A2 實驗之路 建議的方法,擬定你的工作計劃。 請不要完全抄襲 B3 的操作步驟!

 

3. 與教師或同學、助教討論應注意的操作重點,並問清材料、藥品的位置與情況。

 

4. 注意有無停電或停水等通告,若有狀況發生要事先做好預防準備。

 
   

實驗操作時 - 按步就班進行:

 
 

1. 預先把所有藥品及用具準備好,需要預約的材料或儀器,請先登記或預訂。早一天把所有的緩衝液或試劑準備好,不熟的儀器要先學會使用法。

 

2. 在操作前,清理所要使用的桌面,整理藥品與儀器,拋開所有雜務。在正式開動前,再看一次實驗流程。

 

3. 依照所擬的步驟,一步步小心執行,錯誤發生時要小心評估其嚴重性。

 

4. 在操作記錄本上詳細記下每一步驟進行的細節,尤其注意有無意外發現或失誤。

 

5. 使用儀器時,若有任何問題或誤用,請立刻向教師報告,以免延誤。若有臨時停電或停水狀況,視當場狀況決定是要繼續進行,或者另外重新開始。

 

6. 實驗進行時,若在儀器或用具的使用上與他組有衝突,請互相協調禮讓。

 

7. 每天早上十點,準時開始進行實驗,教師將隨時到場觀察各組實驗進行情形。

 
   

實驗操作後 - 收拾好準時完成:

 
 

1. 每階段實驗的收成品,請用微量試管吸取 0.1 mL 冷藏起來,以便最後一起分析。

 

2. 請在規定時間內完成實驗,並收拾所有用過的儀器及藥品,準備移交給下一組。

 

3. 用過的桌面或用具,一定要保持乾淨整齊,不得雜亂無章,否則會影響成績。

 

4. 請立刻整理數據,把結果繪成圖表,準備在次週 One-Page Show 報告。

 

5. 報告 請多用原創性資料或結果,引用他人文章或看法時,一定要註明出處。

 

6. 並不禁止同學參考往年同學留下的實驗報告,但應該效其精華而自行模擬體會,不要一昧照抄;且一旦發現抄襲,將會遭退件。

 
       

X1

     

  酵素化學實驗    

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X1  粗抽與分劃

 

 

        

由植物材料開始,經緩衝液抽取得到粗抽取液,再以硫酸銨分劃收得蛋白質。

 

流程圖

 

 實驗步驟摘要:

 

XT

1. 請先把整個實驗的步驟寫成流程,並整理出兩張表: 藥品試劑儀器用具,本實驗要使用離心機、果汁機及冰浴等,要先確實準備妥當。

 

2. 取約 100 克甘藷,依照澱粉磷解脢的 純化方法,進行粗酵素的抽取。 注意本實驗所抽得的粗酵素 (XT),即為以後各實驗的起始材料。 XT 共 _____ mL。

 

3. 以硫酸銨分劃沉澱蛋白質,每百分之二十飽和濃度收集一次,共有五個分劃。

 

4. 這五個分劃分別溶於最少量的緩衝液,然後對 1× 緩衝液 A 透析過夜,離心去沈澱後測量每個分劃的体積,並進行各項分析工作。

AS

5. 分析檢定的項目包括:蛋白質定量 (Y1) 及酵素活性分析 (Y2);並以電泳及其活性染色檢定磷解脢活性位置 (Y3)。此一步驟的結果,將會得到極重要的指引。

 

6. 依分析或電泳結果,取含酵素較高的分劃,合併後置 4℃ 保存;請注意澱粉磷解脢不耐凍結,請勿放在零下的冷凍櫃中 AS 共 _____ mL。

 

7. 你自己所有的藥品或樣本,一定要寫明: 樣本名稱日期你的姓名

 

8. 本實驗的成品,將在下面的各實驗中用到,若失敗的話將影響到你的實驗進度。

 
 

 

 預期結果:

 
 

1. 五個分劃各有不同的蛋白質含量及活性,請以硫酸銨百分比為橫軸作圖。

 

2. 請注意那一個分劃含有最高的酵素活性,並且蛋白質含量較少。

 

3. 請把硫酸銨各分劃的活性分析與電泳與結果比較,兩者有無對應或相悖之處?

 

4. 請仔細檢討你的結果,可能會有許多不合理的地方,若察覺結果可能有問題,一定要提出合理的解釋及解決方法,不要輕易放過任何嫌疑點,否則將來怕有大患。

 
   

問題與檢討:

 
 

1. 硫酸銨的作用原理是什麼? 能否不用硫酸銨沈澱?

 

2. 何謂比活性? 硫酸銨分劃後應當以比活性來選取所要分劃,或是以總活性來選取?

 

3. 經過本實驗後,發現所要酵素的比活性都沒有增加,則本實驗有沒有必要進行?

 

4. 添加硫酸銨時,前面幾個分劃要加得比較慢,但後面的分劃可以加快,為什麼?

 

5. 若你的五個分劃的酵素活性全都不見了,且活性分析法沒有問題,則你的酵素到底在那裡? 如何去找尋?

 

6. 本實驗的設計,故意安排有一個很大的陷阱,請找出此一陷阱為何。

 
       

X2

     

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X2  膠体過濾法

 

 

        

由硫酸銨沈澱所得到的粗蛋白質,可再經膠体過濾法把不同分子量的蛋白質分離開來。

 

流程圖

 

 實驗步驟摘要:

 

 

1. 同上次實驗,請先把整個實驗的步驟寫好摘要,整理出兩張表: 藥品試劑儀器用具,並請事先清點所有的儀器、管柱及膠体,熟悉其用法及特性。

 

2. 裝填一支 Sephacryl S-300 管柱備用。 以 層析法 純化蛋白質,本來應在冷藏箱內操作,但因為冷藏箱空間不足,全部改在室溫下進行 (夏天時晚上請勿關冷氣)。

 

3. 取出上次所抽得粗酵素之一 (AS),若有沉澱要先離心去除之。

 

4. 取適量粗酵素進行膠体過濾分離,流洗液分劃收集之,準備進行分析檢定工作。

GF

5. 分析檢定的項目: 所有的分劃均進行 蛋白質定量 (Y1) 及 酵素活性分析 (Y2); 取部份具有蛋白質或酵素活性的分劃,以 disc-PAGE 電泳檢定之 (Y3)。

 

6. 依活性分析結果作圖,參考電泳活性染色結果,收集活性較高而雜質較少的分劃,準備進行下一步驟的離子交換法 (X3)。 GF 共 _____ mL。

 

7. 第二天同一管柱要跑標準分子量蛋白質,請在標準分子量樣品中加入 0.2 mL GF。

 

8. 實驗完成後,請把膠体取出放回瓶子,連同管柱、儀器等用品,移交或收存起來。

 

9. 因本操作是在室溫下進行,實驗前後儘量把所有樣本儘快在低溫下貯存。

 
   

 預期結果:

 
 

1. 作圖得到數個蛋白質峰及數個活性峰,收集較強的活性峰,其他的部份即為雜質。但請注意,由活性分析所得到的結果,可能會造成誤判而失去酵素!

 

2. 把畫出膠體過濾管柱的標準分子量校正線,並推出澱粉磷解脢的分子量為多少。

 

3. 由電泳所得結果,與膠体過濾前的樣本比較,可以判斷純化的效果如何。

 
   

問題與檢討:

 
 

1. 膠体過濾法的原理及其分離原理為何?

 

2. 管柱裝填不良及分劃收集器沒有裝置妥善,是較常見的問題,請預先防範之。

 

3. 由硫酸銨到膠体過濾的純化過程,你的酵素活性回收多少? 比活性有無增加?

 

4. 若把你經過膠体過濾法所得到的純化樣本,再通過一次膠体過濾,則對純化效果有無意義? 有沒有例外情形?

 

5. 本實驗並沒有在冷房中進行,可能會有何種影響? 如何增加實驗的可靠性?

 

6. 本實驗的設計,也安排有一個更大的陷阱,請找出此一陷阱為何。

 

7. 上述問題可能也會影響到分子量的測定,請小心討論之。

 
       

X3

     

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X3  離子交換法

 

 

        

離子交換法可以把帶有不同淨電荷的蛋白質分離開來。

 

流程圖

 

實驗步驟摘要:

 

 

1. 同上次實驗,請先把整個實驗的步驟寫好摘要,整理出兩張表: 藥品試劑儀器用具,並請清點所有的儀器、管柱及膠体,熟悉其用法及特性。

 

2. 裝填一支 DEAE Sephacel 管柱備用,請注意離子交換膠体一定要在緩衝液中平衡完全。 以層析法分離酵素本應在冷藏箱內操作,本次也因冷房空間不足,改在室溫下進行 (夏天時晚上請勿關冷氣機)。 在收得樣本後,儘速保持在低溫下貯藏。

 

3. 取出上次膠体過濾法所抽得的酵素 (GF),檢查有無沉澱,有的話要先離心去除之。

 

4. 把樣本注入管柱,並通以緩衝液流洗之,馬上開始分劃收集流洗液;俟洗過兩個管柱体積後,準備以鹽梯度流洗出酵素。 有兩種方法: 連續梯度階段梯度

 

5. 兩種梯度均拉 0.2 到 0.5 M NaCl 的梯度 (階段梯度以 0.1 M 為一階),然後再以 0.5 M NaCl 流洗一個管柱体積。 收起所有梯度分劃,準備進行分析工作。

IEX

6. 分析項目: 所有的分劃均進行 蛋白質定量 (Y1) 及 酵素活性分析 (Y2);然後選取部份具有蛋白質或酵素活性的分劃,以 SDS-PAGE 電泳檢定之 (Y4)。

 

7. 依分析所得作圖結果,參考電泳結果,取活性較高的分劃收集起來,保存在 4℃,準備進行製備式電泳 (X4)。 IEX 共 _____ mL。

 

8. 實驗完成後,請把膠体取出,在玻璃淬砂漏斗中,以緩衝液清洗膠体至平衡,放回瓶子裡,連同管柱、儀器等用品,準備移交或收藏。 使用至此階段,各組濃縮所用的器具 (Centriprep) 要小心檢查是否有破洞,同時濃縮後不要馬上把廢液倒掉。

 
   

 預期結果:

 
 

1. 作圖得到數個蛋白質尖峰及一兩個活性峰,收集較強的活性峰。

 

2. 由電泳所得結果,與離子交換前的樣本比較,你應該可以判斷純化的效果如何。

 

3. 以上各個純化澱粉磷解脢的過程中,以活性分析法可能得到許多活性峰,這些活性峰是否都是磷解脢? 如何判定真假?

 
   

問題與檢討:

 
 

1. 離子交換法的原理及其分離原理為何?

 

2. 離子交換膠体沒有平衡或再生完全,是失敗的主因,請小心此點。

 

3. 硫酸銨-膠体過濾-離子交換純化過程中,酵素活性回收多少? 比活性有無增加?

 

4. 三週來的純化過程中,一路伴隨著正或負的假象 (artifact),對目標酵素的選取會造成誤判,請一一指出。

 
       

X4

     

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X4  製備式電泳

 

 

        

製備式電泳法可以在電泳上把各種蛋白質分開,直接切出色帶並且純化出來。

 

流程圖

 

實驗步驟摘要:

 

 

1. 同上次實驗,請先把整個實驗的步驟寫好摘要,整理出兩張表: 藥品試劑儀器用具,並請清點所有的儀器、大小型電泳槽及供電器,熟悉其用法及特性。

 

2. 依參考講義所述的 製備膠体 型式,進行製備式電泳,電泳槽可以改用迷你電泳槽,但使用最厚的間隔條 (1.5 mm)。

 

3. 電泳要在指定的冷藏箱內操作,請注意冷藏箱內的秩序與整潔,儘量避免打開箱門。

 

4. 樣本使用上次離子交換法所純化得的酵素 (IEX),若有必要則再經超微過濾膜濃縮;直接使用 X1 的備份粗抽取液為樣本時,效果會很差。

PE

5. 在跑製備式電泳之前,應先跑一次迷你式 disc-PAGE 電泳 (Y3),同時做蛋白質及活性染色,以便事先確定澱粉磷解脢的位置。

 

6. 依所計畫的步驟進行電泳,俟追蹤染劑跑出膠体後,在膠體兩側各切出一條垂直膠片,並以活性染色定位之;若同時有數條色帶出現而無法確定,則分別切下來溶離,溶離出來之後才進行確認。 PE 共收得 _____ mL。

 

7. 以電泳溶離器把蛋白質溶出膠体,約兩小時可收一次,共收約四次。 此一步驟最容易損失蛋白質,與收取溶離液的技術有關,要小心練習之。

 

8. 電泳溶離出來的蛋白質進行檢定:蛋白質定量 (Y1) 及酵素活性分析 (Y2),然後以 SDS-PAGE 電泳 (Y4) 檢定其純度。

 

9. 製備式電泳所得到的酵素,將要作為下個實驗的材料,因此請小心收拾;若怕在製備式電泳出錯而影響動力學測定,請留下一些 IEX 備用。

 

10. 實驗完成後,請清點並清理所有電泳及溶離用具,準備移交或收藏起來。

 
   

 預期結果:

 
 

1. 由最後的 SDS-PAGE 結果,你可以看出所純化出來的酵素純度如何。

 

2. 若你是由粗抽取液直接進行製備式電泳,則效果可能很差,會有較多雜質。

 

3. 由切下來的膠体中,溶離出所要的蛋白質,有時會損失很多,如何避免之?

 
   

問題與檢討:

 
 

1.  SDS-PAGE 與 disc-PAGE 兩種膠体電泳,在原理、機制及其應用上,有何異同?

 

2. 製備式電泳的回收率一般都很低,是何緣故? 如何避免或改進之?

 

3. 製備式電泳所切下含有酵素的膠塊,可以直接應用到何種實驗,而不須先經溶離?

 
       

X5

     

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X5  轉印及定序

 

 

        

抗體可以很精準地結合到目標蛋白質;電泳的強大解析力加上抗體的專一性,使得免疫轉印成為最有力的分析工具之一。

 

流程圖

 

實驗步驟摘要:

 

 

1. 同上次實驗,請先把整個實驗的步驟寫好摘要,整理出兩張表: 藥品試劑儀器用具,並請注意轉印槽、免疫試劑的使用法。

 

2. 基本操作方法請看參考講義的 實驗方法,但請整理出你自己的操作流程;另外你可能需要加強有關 免疫化學 方面的基本知識。

 

3. 請先把留下來的五種樣本 (XT, AS, GF, IEX, PE) 進行蛋白質定量,以便依據所得的蛋白質濃度,決定電泳樣本的使用量;每個樣本均定量使用 1-10 mg 蛋白質。

 

4. 小心安排電泳片上的各個樣本 (XT, AS, GF, IEX, PE) 以及 marker 的位置,以便進行 SDS-PAGE,然後轉印到硝化纖維紙上,再以抗體染色。另外準備一片沒有樣本槽的 SDS-PAGE 膠片,以便次日進行二次元電泳。

 

5. 二次元電泳的第一次元先跑 disc-PAGE,在切出所要色帶後,塞入第二次元的 SDS-PAGE 電泳膠片,電泳後進行轉印,快速染色定位所要的蛋白質,切出色帶後送胺基酸自動定序分析。二次元電泳跑得較好,且切得清楚色帶者,才送定序。

 

6. 完成後請清點並清理所有用具,移交或收存,要特別注意免疫試劑的保存方法。

 
   

 預期結果:

 
 

1. 『硫酸銨-膠體過濾-離子交換法-製備式電泳』這一連串純化過程中,你的酵素活性回收有多少? 比活性有無隨著增加? 那一種分離方法效果最佳?

 

2. 免疫轉印後,你可以在轉印紙上看到幾條呈色色帶? 那應該是什麼物質?

 

3. 定序可能要費數週時間,若樣本太雜、太稀,也可能無法成功定序;請把定序結果及搜尋的討論,寫在最後的實驗報告中。

 

4. 請注意澱粉磷解脢的分子特性 (蛋白質降解) 與所觀察到的結果,有何關聯?

 
   

問題與檢討:

 
 

1. 免疫轉印操作過程中,若有任何一步失誤,很容易得到一片空白的結果,特此警告。 因此建議在實驗之前,詳細做好紙上作業,多與同學們或教師討論操作過程。

 

2. 為了切得到所要的目標蛋白質色點,一定要用二次元電泳嗎?

 

3. 得到胺基酸序列後,你可以進行哪些研究工作? 可獲得何種訊息?

 

4. 基本的免疫生理,有一通俗科教影帶可供參考: 人體 (6) - 人體的小戰士 (NHK)。

 
       

X6

     

  酵素化學實驗     

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X6  酵素動力學

 

 

        

酵素動力學是以改變基質濃度,或加入抑制劑等效應物,來觀察酵素反應速率的變化,藉以瞭解酵素與基質的關係,以及酵素的最大反應速率。

 

流程圖

 

實驗步驟摘要:

 

 

1. 請先把實驗的各個項目及詳細步驟寫好摘要,並整理出兩張表: 藥品試劑儀器用具。本實驗全都在做酵素活性的分析,再以作圖整理數據,求得動力學結果。

 

2. 本實驗的基本操作雖然只是酵素活性分析法,但重要的是有關 酵素動力學 的基本概念,如何求出 Michaelis-Menten 常數 (Km) 及Vmax,以及它們所代表的意義。

 

3. 以合成方向而言,澱粉磷解脢有兩個基質 (葡聚醣及 Glc-1-P),可分別測定兩者的動力學常數;若葡聚醣濃度飽和,改變 Glc-1-P 濃度,可測得酵素對 Glc-1-P 的 Km

 

4. 活性分析所得到的原始數據是吸光值,並非酵素的活性單位,故在上述的實驗中,必須同時做一條 吸光值 磷酸濃度 的關係直線,以便把吸光值轉換成活性單位。

 

5. 使用純化的 PE 或者 IEX 樣本;在進行動力學測定以前,必須先決定一個最適當的酵素量,使活性測定所得的吸光值落在 1 - 1.5 之間 (為何要如此?)。

 

6. 另外把所收集到的五個樣本 (XT, AS, GF, IEX, PE),分別進行蛋白質及酵素活性測定,以便整理出 純化表。 在測定各樣本時,要注意各樣本的稀釋度要一致,且所得吸光值也不能太高或太低,以便得到較可靠的結果。

 
   

 預期結果:

 
 

1. 以 Glc-1-P 的 Km 測定為例,若酵素濃度適中,依 [Glc-1-P] 改變可得到一組數據 (吸光值);以 [Glc-1-P] 為橫座標,吸光值為縱座標,可得一曲線;再化為雙倒數座標,則成為一直線,進而求得 Km 及 Vmax。 作圖時請注意兩個座標軸的單位。

 

2. 由動力學結果可以得知酵素對基質的催化行為,但其解讀也要極為小心,以免誤判。 最好多複習相關的生化基本知識,多看一些例子,才能有心得。

 

3. 純化表 可看出整個純化步驟的效果如何,通常是比較其 純化倍數活性回收率 及所得酵素的 比活性 大小; 這些都是從所測得的 蛋白質量活性單位 總體積 等基本資料所算出來的。

 
   

問題與檢討:

 
 

1. 若酵素或基質的濃度不適當,則雙倒數作圖很難畫出直線,故動力學實驗之前就要先決定適當的酵素濃度。

 

2. b-澱粉脢是澱粉磷解脢的抑制劑,你可以用它來做動力學的抑制曲線 (如何做?)。

 

3. 由純化表看來,是否有那些純化步驟沒有什麼效果,但能否因而除去這一步驟?

 
       

建立日期:2001/4/15   更新日期:2001/06/22  © 版權所有