X1

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X1  粗抽與分劃

由植物材料開始，經緩衝液抽取得到粗抽取液，再以硫酸銨分劃收得蛋白質。

流程圖

 實驗步驟摘要：

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XT

1. 請先把整個實驗的步驟寫成流程，並整理出兩張表： 藥品試劑 及 儀器用具，本實驗要使用離心機、果汁機及冰浴等，要先確實準備妥當。

2. 取約 100 克甘藷，依照澱粉磷解脢的 純化方法，進行粗酵素的抽取。 注意本實驗所抽得的粗酵素 (XT)，即為以後各實驗的起始材料。 XT 共 _____ mL。

3. 以硫酸銨分劃沉澱蛋白質，每百分之二十飽和濃度收集一次，共有五個分劃。

4. 這五個分劃分別溶於最少量的緩衝液，然後對 1× 緩衝液 A 透析過夜，離心去沈澱後測量每個分劃的体積，並進行各項分析工作。

AS

5. 分析檢定的項目包括：蛋白質定量 (Y1) 及酵素活性分析 (Y2)；並以電泳及其活性染色檢定磷解脢活性位置 (Y3)。此一步驟的結果，將會得到極重要的指引。

6. 依分析或電泳結果，取含酵素較高的分劃，合併後置 4℃ 保存；請注意澱粉磷解脢不耐凍結，請勿放在零下的冷凍櫃中。 AS 共 _____ mL。

7. 你自己所有的藥品或樣本，一定要寫明： 樣本名稱、日期、你的姓名。

8. 本實驗的成品，將在下面的各實驗中用到，若失敗的話將影響到你的實驗進度。

 預期結果：

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1. 五個分劃各有不同的蛋白質含量及活性，請以硫酸銨百分比為橫軸作圖。

2. 請注意那一個分劃含有最高的酵素活性，並且蛋白質含量較少。

3. 請把硫酸銨各分劃的活性分析與電泳與結果比較，兩者有無對應或相悖之處？

4. 請仔細檢討你的結果，可能會有許多不合理的地方，若察覺結果可能有問題，一定要提出合理的解釋及解決方法，不要輕易放過任何嫌疑點，否則將來怕有大患。

問題與檢討：

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1. 硫酸銨的作用原理是什麼？ 能否不用硫酸銨沈澱？

2. 何謂比活性？ 硫酸銨分劃後應當以比活性來選取所要分劃，或是以總活性來選取？

3. 經過本實驗後，發現所要酵素的比活性都沒有增加，則本實驗有沒有必要進行？

4. 添加硫酸銨時，前面幾個分劃要加得比較慢，但後面的分劃可以加快，為什麼？

5. 若你的五個分劃的酵素活性全都不見了，且活性分析法沒有問題，則你的酵素到底在那裡？ 如何去找尋？

6. 本實驗的設計，故意安排有一個很大的陷阱，請找出此一陷阱為何。

X2

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X2  膠体過濾法

由硫酸銨沈澱所得到的粗蛋白質，可再經膠体過濾法把不同分子量的蛋白質分離開來。

流程圖

 實驗步驟摘要：

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1. 同上次實驗，請先把整個實驗的步驟寫好摘要，整理出兩張表： 藥品試劑 及 儀器用具，並請事先清點所有的儀器、管柱及膠体，熟悉其用法及特性。

2. 裝填一支 Sephacryl S-300 管柱備用。 以 層析法 純化蛋白質，本來應在冷藏箱內操作，但因為冷藏箱空間不足，全部改在室溫下進行 (夏天時晚上請勿關冷氣)。

3. 取出上次所抽得粗酵素之一 (AS)，若有沉澱要先離心去除之。

4. 取適量粗酵素進行膠体過濾分離，流洗液分劃收集之，準備進行分析檢定工作。

GF

5. 分析檢定的項目： 所有的分劃均進行 蛋白質定量 (Y1) 及 酵素活性分析 (Y2)； 取部份具有蛋白質或酵素活性的分劃，以 disc-PAGE 電泳檢定之 (Y3)。

6. 依活性分析結果作圖，參考電泳活性染色結果，收集活性較高而雜質較少的分劃，準備進行下一步驟的離子交換法 (X3)。 GF 共 _____ mL。

7. 第二天同一管柱要跑標準分子量蛋白質，請在標準分子量樣品中加入 0.2 mL GF。

8. 實驗完成後，請把膠体取出放回瓶子，連同管柱、儀器等用品，移交或收存起來。

9. 因本操作是在室溫下進行，實驗前後儘量把所有樣本儘快在低溫下貯存。

 預期結果：

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1. 作圖得到數個蛋白質峰及數個活性峰，收集較強的活性峰，其他的部份即為雜質。但請注意，由活性分析所得到的結果，可能會造成誤判而失去酵素！

2. 把畫出膠體過濾管柱的標準分子量校正線，並推出澱粉磷解脢的分子量為多少。

3. 由電泳所得結果，與膠体過濾前的樣本比較，可以判斷純化的效果如何。

問題與檢討：

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1. 膠体過濾法的原理及其分離原理為何？

2. 管柱裝填不良及分劃收集器沒有裝置妥善，是較常見的問題，請預先防範之。

3. 由硫酸銨到膠体過濾的純化過程，你的酵素活性回收多少？ 比活性有無增加？

4. 若把你經過膠体過濾法所得到的純化樣本，再通過一次膠体過濾，則對純化效果有無意義？ 有沒有例外情形？

5. 本實驗並沒有在冷房中進行，可能會有何種影響？ 如何增加實驗的可靠性？

6. 本實驗的設計，也安排有一個更大的陷阱，請找出此一陷阱為何。

7. 上述問題可能也會影響到分子量的測定，請小心討論之。

X3

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X3  離子交換法

離子交換法可以把帶有不同淨電荷的蛋白質分離開來。

流程圖

實驗步驟摘要：

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1. 同上次實驗，請先把整個實驗的步驟寫好摘要，整理出兩張表： 藥品試劑 及 儀器用具，並請清點所有的儀器、管柱及膠体，熟悉其用法及特性。

2. 裝填一支 DEAE Sephacel 管柱備用，請注意離子交換膠体一定要在緩衝液中平衡完全。 以層析法分離酵素本應在冷藏箱內操作，本次也因冷房空間不足，改在室溫下進行 (夏天時晚上請勿關冷氣機)。 在收得樣本後，儘速保持在低溫下貯藏。

3. 取出上次膠体過濾法所抽得的酵素 (GF)，檢查有無沉澱，有的話要先離心去除之。

4. 把樣本注入管柱，並通以緩衝液流洗之，馬上開始分劃收集流洗液；俟洗過兩個管柱体積後，準備以鹽梯度流洗出酵素。 有兩種方法： 連續梯度 或 階段梯度。

5. 兩種梯度均拉 0.2 到 0.5 M NaCl 的梯度 (階段梯度以 0.1 M 為一階)，然後再以 0.5 M NaCl 流洗一個管柱体積。 收起所有梯度分劃，準備進行分析工作。

IEX

6. 分析項目： 所有的分劃均進行 蛋白質定量 (Y1) 及 酵素活性分析 (Y2)；然後選取部份具有蛋白質或酵素活性的分劃，以 SDS-PAGE 電泳檢定之 (Y4)。

7. 依分析所得作圖結果，參考電泳結果，取活性較高的分劃收集起來，保存在 4℃，準備進行製備式電泳 (X4)。 IEX 共 _____ mL。

8. 實驗完成後，請把膠体取出，在玻璃淬砂漏斗中，以緩衝液清洗膠体至平衡，放回瓶子裡，連同管柱、儀器等用品，準備移交或收藏。 使用至此階段，各組濃縮所用的器具 (Centriprep) 要小心檢查是否有破洞，同時濃縮後不要馬上把廢液倒掉。

 預期結果：

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1. 作圖得到數個蛋白質尖峰及一兩個活性峰，收集較強的活性峰。

2. 由電泳所得結果，與離子交換前的樣本比較，你應該可以判斷純化的效果如何。

3. 以上各個純化澱粉磷解脢的過程中，以活性分析法可能得到許多活性峰，這些活性峰是否都是磷解脢？ 如何判定真假？

問題與檢討：

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1. 離子交換法的原理及其分離原理為何？

2. 離子交換膠体沒有平衡或再生完全，是失敗的主因，請小心此點。

3. 硫酸銨-膠体過濾-離子交換純化過程中，酵素活性回收多少？ 比活性有無增加？

4. 三週來的純化過程中，一路伴隨著正或負的假象 (artifact)，對目標酵素的選取會造成誤判，請一一指出。

X4

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X4  製備式電泳

製備式電泳法可以在電泳上把各種蛋白質分開，直接切出色帶並且純化出來。

流程圖

實驗步驟摘要：

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1. 同上次實驗，請先把整個實驗的步驟寫好摘要，整理出兩張表： 藥品試劑 及 儀器用具，並請清點所有的儀器、大小型電泳槽及供電器，熟悉其用法及特性。

2. 依參考講義所述的 製備膠体 型式，進行製備式電泳，電泳槽可以改用迷你電泳槽，但使用最厚的間隔條 (1.5 mm)。

3. 電泳要在指定的冷藏箱內操作，請注意冷藏箱內的秩序與整潔，儘量避免打開箱門。

4. 樣本使用上次離子交換法所純化得的酵素 (IEX)，若有必要則再經超微過濾膜濃縮；直接使用 X1 的備份粗抽取液為樣本時，效果會很差。

PE

5. 在跑製備式電泳之前，應先跑一次迷你式 disc-PAGE 電泳 (Y3)，同時做蛋白質及活性染色，以便事先確定澱粉磷解脢的位置。

6. 依所計畫的步驟進行電泳，俟追蹤染劑跑出膠体後，在膠體兩側各切出一條垂直膠片，並以活性染色定位之；若同時有數條色帶出現而無法確定，則分別切下來溶離，溶離出來之後才進行確認。 PE 共收得 _____ mL。

7. 以電泳溶離器把蛋白質溶出膠体，約兩小時可收一次，共收約四次。 此一步驟最容易損失蛋白質，與收取溶離液的技術有關，要小心練習之。

8. 電泳溶離出來的蛋白質進行檢定：蛋白質定量 (Y1) 及酵素活性分析 (Y2)，然後以 SDS-PAGE 電泳 (Y4) 檢定其純度。

9. 製備式電泳所得到的酵素，將要作為下個實驗的材料，因此請小心收拾；若怕在製備式電泳出錯而影響動力學測定，請留下一些 IEX 備用。

10. 實驗完成後，請清點並清理所有電泳及溶離用具，準備移交或收藏起來。

 預期結果：

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1. 由最後的 SDS-PAGE 結果，你可以看出所純化出來的酵素純度如何。

2. 若你是由粗抽取液直接進行製備式電泳，則效果可能很差，會有較多雜質。

3. 由切下來的膠体中，溶離出所要的蛋白質，有時會損失很多，如何避免之？

問題與檢討：

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1.  SDS-PAGE 與 disc-PAGE 兩種膠体電泳，在原理、機制及其應用上，有何異同？

2. 製備式電泳的回收率一般都很低，是何緣故？ 如何避免或改進之？

3. 製備式電泳所切下含有酵素的膠塊，可以直接應用到何種實驗，而不須先經溶離？

X5

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X5  轉印及定序

抗體可以很精準地結合到目標蛋白質；電泳的強大解析力加上抗體的專一性，使得免疫轉印成為最有力的分析工具之一。

流程圖

實驗步驟摘要：

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1. 同上次實驗，請先把整個實驗的步驟寫好摘要，整理出兩張表： 藥品試劑 及 儀器用具，並請注意轉印槽、免疫試劑的使用法。

2. 基本操作方法請看參考講義的 實驗方法，但請整理出你自己的操作流程；另外你可能需要加強有關 免疫化學 方面的基本知識。

3. 請先把留下來的五種樣本 (XT, AS, GF, IEX, PE) 進行蛋白質定量，以便依據所得的蛋白質濃度，決定電泳樣本的使用量；每個樣本均定量使用 1-10 mg 蛋白質。

4. 小心安排電泳片上的各個樣本 (XT, AS, GF, IEX, PE) 以及 marker 的位置，以便進行 SDS-PAGE，然後轉印到硝化纖維紙上，再以抗體染色。另外準備一片沒有樣本槽的 SDS-PAGE 膠片，以便次日進行二次元電泳。

5. 二次元電泳的第一次元先跑 disc-PAGE，在切出所要色帶後，塞入第二次元的 SDS-PAGE 電泳膠片，電泳後進行轉印，快速染色定位所要的蛋白質，切出色帶後送胺基酸自動定序分析。二次元電泳跑得較好，且切得清楚色帶者，才送定序。

6. 完成後請清點並清理所有用具，移交或收存，要特別注意免疫試劑的保存方法。

 預期結果：

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1. 『硫酸銨-膠體過濾-離子交換法-製備式電泳』這一連串純化過程中，你的酵素活性回收有多少？ 比活性有無隨著增加？ 那一種分離方法效果最佳？

2. 免疫轉印後，你可以在轉印紙上看到幾條呈色色帶？ 那應該是什麼物質？

3. 定序可能要費數週時間，若樣本太雜、太稀，也可能無法成功定序；請把定序結果及搜尋的討論，寫在最後的實驗報告中。

4. 請注意澱粉磷解脢的分子特性 (蛋白質降解) 與所觀察到的結果，有何關聯？

問題與檢討：

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1. 免疫轉印操作過程中，若有任何一步失誤，很容易得到一片空白的結果，特此警告。 因此建議在實驗之前，詳細做好紙上作業，多與同學們或教師討論操作過程。

2. 為了切得到所要的目標蛋白質色點，一定要用二次元電泳嗎？

3. 得到胺基酸序列後，你可以進行哪些研究工作？ 可獲得何種訊息？

4. 基本的免疫生理，有一通俗科教影帶可供參考： 人體 (6) - 人體的小戰士 (NHK)。

X6

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X6  酵素動力學

酵素動力學是以改變基質濃度，或加入抑制劑等效應物，來觀察酵素反應速率的變化，藉以瞭解酵素與基質的關係，以及酵素的最大反應速率。

流程圖

實驗步驟摘要：

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1. 請先把實驗的各個項目及詳細步驟寫好摘要，並整理出兩張表： 藥品試劑 及 儀器用具。本實驗全都在做酵素活性的分析，再以作圖整理數據，求得動力學結果。

2. 本實驗的基本操作雖然只是酵素活性分析法，但重要的是有關 酵素動力學 的基本概念，如何求出 Michaelis-Menten 常數 (K_m) 及V_max，以及它們所代表的意義。

3. 以合成方向而言，澱粉磷解脢有兩個基質 (葡聚醣及 Glc-1-P)，可分別測定兩者的動力學常數；若葡聚醣濃度飽和，改變 Glc-1-P 濃度，可測得酵素對 Glc-1-P 的 K_m。

4. 活性分析所得到的原始數據是吸光值，並非酵素的活性單位，故在上述的實驗中，必須同時做一條 吸光值 與 磷酸濃度 的關係直線，以便把吸光值轉換成活性單位。

5. 使用純化的 PE 或者 IEX 樣本；在進行動力學測定以前，必須先決定一個最適當的酵素量，使活性測定所得的吸光值落在 1 - 1.5 之間 (為何要如此？)。

6. 另外把所收集到的五個樣本 (XT, AS, GF, IEX, PE)，分別進行蛋白質及酵素活性測定，以便整理出 純化表。 在測定各樣本時，要注意各樣本的稀釋度要一致，且所得吸光值也不能太高或太低，以便得到較可靠的結果。

 預期結果：

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1. 以 Glc-1-P 的 K_m 測定為例，若酵素濃度適中，依 [Glc-1-P] 改變可得到一組數據 (吸光值)；以 [Glc-1-P] 為橫座標，吸光值為縱座標，可得一曲線；再化為雙倒數座標，則成為一直線，進而求得 K_m 及 V_max。 作圖時請注意兩個座標軸的單位。

2. 由動力學結果可以得知酵素對基質的催化行為，但其解讀也要極為小心，以免誤判。 最好多複習相關的生化基本知識，多看一些例子，才能有心得。

3. 純化表 可看出整個純化步驟的效果如何，通常是比較其 純化倍數、活性回收率 及所得酵素的 比活性 大小； 這些都是從所測得的 蛋白質量、活性單位 及 總體積 等基本資料所算出來的。

問題與檢討：

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1. 若酵素或基質的濃度不適當，則雙倒數作圖很難畫出直線，故動力學實驗之前就要先決定適當的酵素濃度。

2. b-澱粉脢是澱粉磷解脢的抑制劑，你可以用它來做動力學的抑制曲線 (如何做？)。

3. 由純化表看來，是否有那些純化步驟沒有什麼效果，但能否因而除去這一步驟？