每週報告答問錄 2003

1	下面各記錄中，紫色文字為指導教師的建議或意見；橘紅色文字為總結。
2	優先只列出第一優先者，標以 1；並以 * 代表要特別小心的陷阱。
3	報告時先要把你的實驗流程檢討一次，且每次都要回顧上次的流程與記錄。
4	報告時一定要請同學幫你記下討論過程的問答，以便整理出下面 (D) 的答問錄。
5	後續整理請交出 (R) 以條列方式列出報告的各項成果 (D) 條列討論過程的答問錄。
6	請儘量在報告的當週週末完成上面 (5) 後續整理，貼到 Meeting Room 520-2 上。

暑假中進度報告將暫停，請努力累積結果開學將馬上驗收成果。

030611 進度報告答問錄廖珮秀 (6)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 6 > Final
	由 2DE 轉印挖出 PCS 的可能色點進行定序。
R1	使用三種抗體對 2DE 轉印膜呈色，標定 PCS 可能位置，將色點進行胺基酸定序。
R2	N-端定序結果大部分色點均為 N-端 blocked，只有兩個色點定出序列，其中之一點與阿拉伯芥假設的 PCS 有高相似度。
R3	另送 LC-MS/MS 結果由於操作人員失誤，因此無實驗結果。
R4	SDS-PAGE 中的 110 kD 色帶應為 A + B 呈色系統所造成的非專一性呈色。
R5	改由 2DE 方式的 TCA 樣本處理，原先 PCS 在 2DE 的 110 kD 處不會被抗體偵測到，但是在 1DE 的 SDS-PAGE 中，110 kD 處卻仍有非專一性呈色。

D1	可能要以不同的轉印膜，分別對各抗體呈色，以確定所抓到的色點是否為同一點。
D2	抗體專一性仍相當存疑，在 2DE 利用不同抗體呈色以尋找 PCS 的方法需再確認。	*
D3	在 2DE 負極緩衝液添加 thioglyco acid (?)，可降低蛋白質在電泳過程 N-端被 blocked。	*
D4	以不同方式處理 PCS，在免疫呈色的結果也不同，其原因不單純，可能不只是金屬離子對蛋白質構形的影響所造成。
D5	抗體對 PCS 活性影響的實驗，需再嚴謹設計，進行確認。
D6	LC-MS/MS 的定序仍需持續進行。

★	雖然 2DE 中有一點是 PCS 的片段，但整個 2DE 的結果仍然不很清楚。
	三種抗體中看來還是 12F9 最強，也許可做成親和管柱去抓 PCS 來定序。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

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030528 進度報告答問錄賴心屏 (6)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 6 > Final
	所純化出來的磷酸脢並無法對 L-SP 去磷酸，可能含量太低。
R1	以連續層析步驟純化出的磷酸脢，對 L-SP 無法有去磷酸作用。

D1	確定甘藷塊根中有無 L-SP 專一性之磷酸脢，可使用粗抽液與 total protein (0-90%) 分別測試，要同時加入 protease inhibitor 及 proteasome inhibitor。	1
D2	另試以 45C 處理甘藷切片，觀察加熱能否誘導產生 L-SP 的專一性磷酸脢活性。	1
D3	純化表及活性染色都要加 SDS-PAGE 結果，與 disc-PAGE 作為對照。	*

★	重作純化過程的 disc-PAGE，並加重樣本量 (>10 mg/well)，看是否有 L-SP 磷酸脢。
	最低限度是證實目前的組織與條件，並沒有 L-SP 的專一性磷酸脢，但有其他者。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

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030521 進度報告答問錄林怡岑 (6)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 6 > Final
	Proteasome inhibitor 對 HX 的影響。
R1	Crude extract 中可能有 19S proteasome regulator 可加速 HX 降解。 (此結論待查)	?
R2	SDS 造成 HX 的泳動率變快，可能是因為致使 proteasome 的活性變強。
R3	在 pH 10 時，HX 的泳動率變快，可能是因為 proteasome 的活性變高降解 SP。
R4	Double staining 的結果顯示，SP 和 proteasome 可能互相結合。

D1	論文中的名詞請使用專業術語，整體文字必須簡潔而中肯 (moderate)。
D2	各梯次的 double diffusion 結果好壞互見，收集比較好的幾張放在一起比較。
D3	HX 經各種變性處理之 Western blotting 檢定，需重新找好條件再試，看是否含 L-SP。	1
D4	每天取一點 4℃ 中的 HX 放置於 -20℃中急凍，一起觀察 HX 貯存過程的活性變化。	1
D5	HX 活性變化實驗，要以 SP only 作為 control，並確定 sample 中的 pH 值。
D6	Proteasome inhibitors (lactacystin) 和 ATP 對 HX 活性影響實驗要重做。	*
D7	HgCl₂ 的抑制時間必須相同，電泳可跑久一點，使 HX 位於膠片中間。
D8	查出 ATP 是抑制還是促進 proteasome 的活性。
D9	找出可用的 anti-proteasome mAb。
D10	重複螢光染色的問題，需找出方法解決，可向 513 借用螢光顯微鏡。
D11	Double staining 用連續切片單獨染色即可，另外需加 AP 呈色作為 control。	1

★	把已有的結果整理好 (如雙向擴散)，然後儘量把未完成的工作作好 (如組織染色)。
	Lactacystin 好像無法抑制 HX 降解，反而 protease inhibitor 可以，。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

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030514 進度報告答問錄吳裕仁 (3)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 3 > 下次報告
	蛋白質體的免疫過程，抗體會有消長情形。
R1	17 cm 的 2DE 圖譜與小的 2DE 圖譜相當不同，要重新建立標準流程。
R2	六個色點開始定序，LC/MS/MS 比 N-端定序靈敏精準，所得序列還湊不出相關性。
R3	蛋白質體免疫過程已經三個月，抗體的組成確實會有消長情形 (見上圖)。
R4	抗體庫已進行第一次融合，1DE 免疫篩選器可用，建議提高抗原量以篩出低量者。

D1	繼續對 17 cm 的 2DE 確立流程，以建立 2D 標準圖譜，才能開始下游工作。
D2	然後以分析軟體比對出有變化的蛋白質，進行 N-端定序或 LC/MS/MS，確定身分。
D3	抗體庫工作繼續進行，需要大量人力，請新生多多參與，也要找到能幹的助理。
D4	試進行非水溶性竹筍蛋白質的免疫，並確立非水溶性蛋白質的 2DE 圖譜。

★	確定 17 cm 的整個流程，然後再去進行原計畫所預定的目標。
	抗體庫先以未出土為對象，大體先進行過一次很重要，然後再一邊改進。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

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030430 進度報告答問錄王信傑 (8)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 博士班資格考試 > 下次報告
	以 PCS 單株抗體檢測 2DE 圖譜。

	張老師：
1	PCS 純化過程應完整列在論文中，包括純化表等，便於讓大家迅速瞭解整個流程。
2	如何確定圖 3.12 中的 peak 即是 PC₂？又如何證明 GSH 與 GSSG peaks？
	重複收集 peak 後進行酸水解，再進行胺基酸組成分析。發現 Glu/Gly 比值約為 2，可確定為 PC₂。因 Cys 會形成氧化態，故不以 Cys 來比較。 GSH 與 GSSG peak 可只跑標準品來確定。
3	圖 3.10 規律變化的 peaks 在 multiple charge 的圖譜中相當少見，有可能是配位化合物所造成，也有可能鎘已不見，可利用 tandem MS 來分析每根 peak 組成。	*
4	題目中的『重金屬』應去掉，只稱呼『鎘』即可。

	陳老師：
1	本實驗室之前也曾研究過這個酵素，遇到一個問題，在經 HPLC 純化後為單一 peak，但是經電泳後卻發現此蛋白質似乎會黏在一起，因而出現多條 bands。有可能是因為含 Cys 較多的蛋白質會出現這種現象，所以在進行實驗前應先還原雙硫鍵。	*
2	關於金屬光澤是否為含硫化合物，或是屬於配位化合物，這些都是屬於無機化學方面問題，化學系有開相關課程，若要繼續從事這方面研究，應該加強相關背景知識。
3	有無想利用表現方式來研究 PCS？
	PCS 的表現已有許多研究團隊做過，但純化方面卻很少，因此從事這方面研究較具特色及競爭力，而且純化所得蛋白質其功能性質也較符合 in vivo 狀態。
4	『二次元電泳』請改為『二維電泳』較為恰當。
5	如何從你的二維電泳來定義 PCS ?
	利用單株抗體所進行之 Western blot 只抓到幾個蛋白質色帶，可針對這幾點加以定序分析，當然也可進一步純化後再進行二維電泳。

	楊老師：
1	目前已推斷出 PCS 序列，請問有沒有人將其表現出來？應隨時 review PCS 文章，知道目前進度為何。
	已知有人將阿拉伯芥的 PCS 基因表現在 E. coli 中，的確可以加強 E. coli 對鎘的耐受性。
2	有人發表 PCS 就是 glutathione synthetase，而且最近也在線蟲中發現 PCS gene，你認為 PCS 的作用是演化上的壓力或是適應環境的結果？	*
	PCS 就是 glutathione synthetase 這個我倒是沒注意到，不過一般認為 PC 合成途徑應如圖 1.1 所示。演化需要時間考驗，重金屬污染也不過是近幾世紀才越來越嚴重，而且 PC 的作用也不只是與重金屬結合而已，另外還有平衡金屬離子濃度及抗氧化的作用，因此 PCS 有可能因應環境變化來作用。
3	多 review 前人 papers，對 PCS 之其它作用也應詳加介紹。

	李老師：
1	你的實驗都是延續之前學長所作的題目，比較吃虧是較沒有自己的方向，今後應強調自己所研究新的部份。
2	兩個研究題目範圍都很大，選擇其中之一進行即可，若要選擇，請問你會選擇那一個題目進行？	*
	我會選擇 PCS 的題目進行，因為這個方向較為明確。H6 是個新發現，雖然目前還不能確定其組成，但是潛力無限。若有時間的話，這方面我仍會繼續研究。
3	論文上仍有些小缺點要注意，屬名第一次出現應標示全名。題目訂定似乎不太恰當，可以等到實驗累積一定成果時再來定題目。
4	不管是從蛋白質方面或是分生方面著手，都應注意其優缺點，這就是我考你第三題的目的，可以的話應兩者並重，對實驗思考會有很大幫助。

	研究報告討論：
D1	HPLC 色析圖譜應該加上座標軸以利判讀。
D2	題目寫法有待商榷，等到實驗進行一定成果時，再予確定。
D3	強調自己所做之 PCS 單株抗體與別種抗體的差異，並討論色帶專一性不同的原因。
D4	以本實驗室之 PCS 研究大綱為藍圖，畫出本論文的研究範圍及目標。
D5	最後應加上一張未來研究方向之詳細計畫表，作為將來的研究主軸。	*

★	未來將專注在 PCS 方面的酵素學研究，先把純化、抗體、基質等工具建立好。
	確定的成果較少，研究要更有效率，在困難發生時，抓對要點，解決問題。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

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030423 進度報告答問錄楊光華 (12)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 12 > 下次報告
	磷酸化及去磷酸化。磷酸化的 Ser。
R1	將利用胺基酸定序及質譜儀兩種工具，交互驗證 SPPK 胺基酸的定序結果。
R2	SPPK 的純化倍率可改採製備式電泳溶離步驟，以避免膠體過濾法的低回收率。
R3	Staurosporine, ML-7, H-89 可抑制 SPPK 活性，而其中以 staurosporine 效果最佳。
R4	TLC 雙向薄層電泳檢定結果證明 SP110, F50s, L78 的磷酸化胺基酸為 Ser。
	但是好像有一點 Tyr 被磷酸化。	*
R5	基質專一性檢定結果顯示 SPPK 可將 L78 及 L-SP 磷酸化，而不含 L78 的 H-SP 則否。
R6	製備 anti-L78 及 anti-SPPK 抗體，其中 anti-SPPK 的製備方式須重新檢討。
R7	甘藷 45C 加熱處理配合蛋白質體及免疫學工具觀察與 SP 磷酸化之生理意義。	1
R8	添加粗抽液誘導降解或運用蛋白脢抑制劑，探討 SP 磷酸化與去磷酸化之降解機制。

D1	表現蛋白質 L100 其中只含有 L78 的序列，故名稱改回 L78。
D2	可以 cold ATP 取代 hot ATP，觀察磷酸化前後的 SP 各項差異。
D3	純化表要注意有效數字的表示法。
D4	比較 SPPK 對於不同基質專一性的結果，儘可能調整基質蛋白質量一致。
D5	SPPK 最適反應 pH 實驗，要將各種不同緩衝範圍的緩衝液混合在一起。	*
D6	查詢鎂離子和錳離子的化學性質，了解為何兩者皆可作為激脢的輔因子。	*
D7	磷酸化與去磷酸化動力結果圖中曲線改直線，另外不添加 ALP 組以空心圓表示。
D8	L78 的磷酸化胺基酸位置，應補足二次元 TLE 結果。

★	確定 SPPK 對 SP 的磷酸化，以及其磷酸化位置為 Ser，並可能都在 L78 片段上。
	開始把所有重要結果的圖表整理出來，以便進一步發表之用。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

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030326 進度報告答問錄廖珮秀 (5)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 5 > 下次報告
	免疫沈澱法以抗體 12F9 抓下 PCS 並用另一種抗體進行呈色。
R1	3H8 及 W11E 在稀釋 1000 倍時呈色效果不佳，需增加使用濃度。
R2	可用抗體製作親和性層析管柱 (例：CNBr-activated Sepharose 4B) 純化 PCS，或使用二維電泳分離 PCS，以進行定序，及再製備 PCS 抗體。
R3	DEAE X 部分仍有相當活性，但好像不會因為與抗體吸附而降低活性。

D1	電泳樣本要取固定量，轉印及免疫呈色過程要穩定，結果之比較才有相同基準。	*
D2	活性測定時要做未加基質的控制組。
D3	2DE 轉印呈色可先用較弱的抗體呈色並標定位置，再用另一抗體確認位置異同。	1
D4	抗體是否會抑制 PCS 活性實驗結果需再確認。	*
D5	DEAE X 中的 110 kD 色帶需再確認是否不加一抗也能呈色。	*

★	PCS 的純化流程要固定，儘快以任何方法切出色帶，進行胺基酸定序或 LC-MS-MS。
	要釐清三種抗體與 PCS 是否有專一性確認關係，各種實驗技巧要確實。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

030226 進度報告答問錄林怡岑 (5)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 5 > 下次報告
	在 PVDF 轉印紙上對 HX 進行變性以便露出 SP
R1	HX 在 pH 7.5 環境下溶離出來的活性稍微高一點。
R2	HX 和 20S proteasome 的位置並沒有重疊，可能 SP 被 20S proteasome 包住。
R3	HX 經 6 N HCl 37C 處理 2 h 後，其 SP 免疫呈色的 band 和 proteasome 重疊。

D1	Double diffusion 實驗中，proteasome 添加量都太少了，全需重做。	1
D2	PVDF 膜上 protein denature 實驗，需補做 M71C1 (HX 處理 6 N HCl 37C, 2 h)。	1
	為何 6 N HCl 處理後，H7c 都抓不到 SP？ (上圖 Lane 4)	*
D3	HX 在試管中添加酸、鹼、SDS 或 proteasome 抑制劑，觀察其降解情形。
D4	所有 Western 都需附一張 CBR 染色圖。	*
D5	改進電泳及轉印技巧，因為結果時好時壞。
D6	需做 HX 純化過程之流程圖。
D7	連續切片無說服力，暫停實驗；全力主攻組織雙重染色，找出最適合條件。
D8	可利用 avidin 和 biotin block 第二次染色 A + B 的交叉反應。	?
D9	看看是否要做 chicken anti-proteasome 的 IgY。
D10	利用連續切片只做一種染色，做為雙重染色的對照。	?
D11	若 double staining 呈色剛好重疊，將無法觀察到。	?
D12	若兩個 antigen 重疊，第二個 antigen 可能無法在 second staining 中被抗體抓到。	?
D13	免疫螢光呈色有問題，需檢討實驗步驟並試著放大 signal。
D14	45C 加熱實驗有空重做，組織切片要有未加熱的切片作為 control。
D15	可利用 ELISA 方式以各種抗體探討 HX 中 SP 和 proteasome 之間的結合關係。	1

★	Proteasome 是如何純化的？裡面會不會結合有 SP？若是如此，要重新解釋結果。
	把雙向擴散完整結案，還有 (1) PVDF 處理 (2) ELISA 結合 (3) 組織定位等三個重點。
	論文前言要仔細回顧世宗及安娜的結果。
	(上面進度報告還有問題必須進一步討論)
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

030115 進度報告答問錄楊光華 (11)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 11 > 下次報告
	被磷酸化的 SP 比較不容易被粗抽取液降解
R1	酵素純化表計算方式與其他激脢報告比較無太大差異，純化倍率應可再提高。
	離子交換法要再檢討。活性單位大小可以自訂。請有效使用『有效數字』。
R2	大量製備 mAb Y4W 及其他抗體之腹水；並對 SPPK 的專一性進行效價測試。
	抗體效價不高，請檢討原因；SPPK 專一性似無問題，再用其他方法確認。
R3	SP 的磷酸化與去磷酸化之生理功能，可朝降解速度的差異進行探討。	1
	用 crude extract 添加造成降解，並利用專一性抑制劑探討降解機制。
R4	以 2DE 轉印進行 SPPK 的 N-端定序，另嘗試確認 SPPK 磷酸化 L-SP 的位置。	1
	L100 的實驗可以繼續探討，因為是有關基質專一性及磷酸化位置的良好工具。
	先被 cold ATP 磷酸化的 SP 較不易被 SPPK 標上放射線，可間接證明 SP 磷酸化。但此實驗要確定所加的 SP 與 SP-P 量是一樣，否則可能有假象 (Western 好像不同量)。
	SP 與 SPPK 的添加次序會影響磷酸化，可能是因於 ATP 的不穩定，很快被利用掉。

D1	純化表部份，應該比照其他論文做法，定義酵素活性單位 (建議用 n mole)。
D2	以放射線對 SP 進行磷酸化 pulse 後，再以 ALP 去磷酸 chase，觀察磷酸化動力學。	1
D3	以 phosphocellulose 純化 SPPK 時，因高濃度磷酸而使得 SPPK 活性下降，要透析去除磷酸，以免純化表的活性降低而誤導。	*
D4	進行 SPPK 各項性質分析時，要嚴格控制每次 SP 添加量，使結果具一致性。	*
D5	磷酸化的 SP 較不易受到降解，可用 SP, SP-P 及 ALP 交互混用，觀察各種變化。

★	重要結果可開始累積圖表，做好的圖表隨時送給教師修改，不理想的要重做。
	不要忘記應用在加溫的實驗，同時考慮能否在細胞活體中觀察到磷酸化。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

030212 進度報告答問錄吳裕仁 (2)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 2 > 下次報告
	全體蛋白質的抽取方法確實會影響所得到的蛋白質體組成
R1	完成 pH 7-10 之 2DE 圖譜。
R2	竹筍水溶性與非水溶性蛋白質的 2DE 圖譜，確實有很明顯的差異 (上圖)。
R3	抗體庫的先導實驗，發現竹筍蛋白質隨免疫時間越久，可抓到的蛋白質越多。
	但是好像免疫呈色圖譜會有變化，是染色的問題？還是真的是免疫的不同反應？	*

D1	進行非水溶性蛋白質抽取之前，殘渣部分應該用粗抽 buffer 多洗幾次，以便徹底去除所有的水溶性蛋白質，以免夾雜在非水溶性的部份。	1
D2	免疫老鼠使用 Titer Mix 為佐劑，但免疫反應不理想，可試用傳統之 Fruend's 佐劑。	1

★	儘可能先定出一些蛋白質來，看能否湊成一條代謝路徑。
	要決定 2DE 的標準條件：膠片大小、pH 範圍、抽取方法，以便建立標準圖譜。
	抗體庫部份可以開始融合，並且先小規模試做。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討

030122 進度報告答問錄王信傑 (7)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 7 > 下次報告
	mAb 12F9 可結合大小兩群色帶而 W11 及 W3 只與大分子色帶結合
R1	可嘗試用 Centriplus YM-1 去除鎘離子，並留下 H6 complex。
R2	在 Biopanning 中溶離液 imidazole 的濃度應該增加 (> 50 mM)，或者用酸性緩衝液連同鎘離子一起溶離下來。
R3	可嘗試直接進行胺基酸定序，或找其它分析小分子的方法。

D1	用 yeast crude extract 直接進行 2DE 電泳，再以 W11E 與 12F9 進行免疫轉印。
D2	確認 W11E 與 12F9 所辨識的是否為 PCS。	1
D3	直接由膠片挖下疑似 PCS 的 band，進行胺基酸定序。	1

★	還是盡全力探討 PCS，而其第一要務是把正確的 mAb 找出來。
	對大小兩種染上色的 PCS 色帶，也許都有可能是 PCS，但必須釐清分子關係。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討


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030319 進度報告答問錄賴心屏 (5)
	記錄事項	優先
	上次報告 < 5 > 下次報告
	在磷酸脢存在下，磷酸化的 SP 可被去磷酸 (但再現性仍有問題)。
R1	試驗各純化方法，確定五個步驟，但進行活性染色結果無法呈色。
R2	各種不同磷酸脢的純化表起伏不定，要決定一種主要純化流程。
R3	純化結果定序可能為 (1) EMNNIDDD (2) APPSASRQ (3) APNAGDDD。
R4	SP 以放射線磷酸標示後，用所純化磷酸脢進行水解，結果或許可以去磷酸 (上圖)。

D1	確定磷酸緩衝液可否應用在溶離結合到 phosphocellulose 之蛋白質。	1
D2	磷酸脢活性分析要減少樣本量，或縮短反應時間，以免超出光度計可測範圍。	*
D3	電泳前樣本可先經由微量濃縮管，避免蛋白質太稀，同時要定量好。
D4	確定 imidazole 之緩衝範圍為 5.95-7.95 (pKa = 6.95)。	*
D5	減少粗抽所用的甘藷重量，以免超過膠體承載容量 (capacity)。	1
D6	Native-PAGE 可試用銀染，同時轉印結果都要附上蛋白質染色結果，以便比對。	*
D7	金屬離子濃度有適當使用範圍；所購得抑制劑要小心其溶劑及溶解度的影響。	*
D8	實驗的操作要穩定，結果要有再現性，並且注意作好對照組。	*
D9	放射線實驗要用較純的樣本進行，太雜的蛋白質容易造成干擾。

★	確立標準純化流程，確定是那一個磷酸脢，然後建立其純化表，並送定序確認。
	實驗事前的設計與考量要極為周密，以免檢討時缺少重要對照或參考。
以上各項工作結果請於下次報告中提出檢討