520 會議記錄答問錄

到生化社區： 簡 介  總值星  緊急反應  行事規章 ｜ 到共同儀器室 

Lab 520:  公佈欄｜磷解脢｜重金屬 ｜人員｜地圖｜行事曆｜分工｜前程設計｜畢業生｜ 回 520 研究室首頁

下面各記錄中，灰色文字為指導教師的建議或意見；紫紅色文字為總結。

優先只列出第一優先者，標以 1；並以 * 代表要特別小心的陷阱。

報告者若發現內容與報告原意不符，或其他任何人有任何意見，請儘速告知修正。

報告幻燈片放在 Meeting Room，但進入 520-1 電腦要先打過密碼，且必須用 IE 6.0。

報告時先要把你的 實驗流程 檢討一次，並且每次都要回顧上次的流程與進度。

後續整理請交出 (R) 條列報告的各項結果 (D) 條列報告中大家討論的結論。

請儘量在報告的 當週週末 完成後續整理 (6) 工作，貼到  Meeting Room 上。 

021225  進度報告答問錄  賴心屏 (4)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LSP021225.ppt] 要密碼

使用 L100 直接免疫的血清測試

還是要先把握住 L100 的抗體，有抗體後就能做一些磷酸化的探討。

1

L78⁺ 還是改成 L100 比較容易辨別。

另外，L100 的表現與純化步驟，可以再加修正，以求穩定的 L100 來源。

1

磷酸脢的純化流程需要再檢討，對 SPPK 所磷酸化的 SP 暫時看不到去磷酸的活性。

D1

L100 的純化要穩定： 純化步驟、菌的表現及誘導 (如 R2)。

D2

每張轉印圖都要有 CBR 對照，且電泳樣本一定要定蛋白質量。

D3

Phosphatase 硫酸銨分劃可收 50~90% 飽和度範圍。

D4

Phosphacellulose 可試改用磷酸 buffer，也許溶離效果較佳。

D5

轉印改用不含甲醇的 CAPS。

D6

報告幻燈片上面的圖片說明與安排要更加詳細，以便使讀者清楚而快速瞭解。

設計實驗要更嚴謹，各實驗步驟及試劑的規劃及定量等，都要更仔細。

還是以 L100 為論文主題，這些實驗應可順利做出來，但就是要更多嘗試與細心。

有任何結果或問題，請馬上與我討論，以免誤入岔路，消耗寶貴時間。

021218  進度報告答問錄  廖珮秀 (4)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [進度報告(1)021211 poi.ppt] 要密碼

各種單株抗體抓到不同的 PCS (?) 色帶

PCS-At 抗體目前已到單株化，接下來製作腹水 (編號 At l-A1, At l-C1)。

1

免疫呈色的深淺居然比 CBR 染色差很多，抗體效價不夠？ 或呈色方法有問題？

免疫呈色結果 12F9 (邱創儉) 和抗 PCS-At 單株抗體對 PCS 的 epitope 可能不同。

*

活性較高的 PCS 其分子量較大 (SDS-PAGE)，不知為何，需再確認 (不同降解？)。

*

D1

改善免疫呈色的效果，如一抗使用腹水，或改用 ABC 呈色系統；當必須使用培養液上清當作一抗時，要用 NET 做 1:1 稀釋，可減少非專一性吸附。 

D2

Tricine SDS-PAGE 中 PCS-At 的分子量過高，要再確認 PCS-At 的分子量。

D3

設法改進 PCS 的純化步驟，例如改用其他方法脫鹽，或改變純化步驟的順序，以提高產率及活性；另外要固定每次分劃收取的條件，維持每次純化品質的穩定度，以確認 PCS 是否有高活性高分子量的現象。

1

D4

未來可利用不同 epitope 抗體進行 pull-down 及其他實驗。

D5

由邱創儉論文中發現，在 hydroxylapatite 分劃中，活性範圍和 12F9 免疫呈色範圍有錯開的現象，但 12F9 對純化所得均質 PCS 仍可抓到，和本實驗結果相似，因此仍要繼續追蹤 12F9 單株抗體所抓為何。

D6

要清楚了解實驗中各種步驟、試劑、處理的基本知識，例如：MAPS 為何物？

趕快把工具作好，才能盡全力做細胞生理探討，可以暫時不管動力學部份。

光是以兩種抗體去研究 PCS 的構造就已經很忙，另外還可以用來作組織定位。

021211  進度報告答問錄  莊博為 (1)

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [進度報告(1)021211 poi.ppt] 要密碼

注意 citrinin 抽取的過程與回收率。

1

酵素免疫分析法、HPLC 先互相比較後，再和微流體平台結果比較。

注意 1st antibody titer 有無下降。

目前大致只是重複一次已建立的流程。以上結果摘要有點簡便，應該再加琢磨。

系統靈敏度的提升：(1) 操作的技巧磨練  (2) 1st  antibody  的使用濃度要適當。

小心證明 ELISA 的抑制並非來自甲醇 (更改溶劑甲醇的百分比)。

AP 呈色系統中 diethanolamine 的功用：鉗合 AP buffer 中的 Mg (為何需要如此？)

整體操作技巧要提升，以便有較佳的再現性與零敏度，兩者都熟練後才能進行實驗。

要小心 citrinin 的抽取方法，趕快把已知的樣本取來以 ELISA 法先檢測一次。

021127  進度報告答問錄  林俊良 (1)

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LCL021127 進度報告.ppt] 要密碼

以硫酸銨分劃、DEAE 離子交換分離甘藷塊根之磷酸脢，並以轉印活性染色檢定。

注意磷酸脢有很多種，目標是找出對 SP 專一性的磷酸脢。

1

雖然與 LSP 題目有部份重疊，但重心放在抗體的生產，以及將來的組織定位等。

報告幻燈片整理應該可以更為正確、清楚；實驗設計可以更完整、進度可以更快。

報告後除了依規定交出幻燈片外，要整理出結果大要、討論摘要等附上。

021120  進度報告答問錄  林怡岑 (4) 上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LYC-021120 進度報告 4.PPT] 要密碼

 雙向免疫擴散顯示 SP 與 proteasome 結合在一起 

R1

在原態電泳轉印膜上，HX 和 20S proteasome 的位置並沒有重疊，但 20S proteasome 和 ubiquitin 的位置則有部份重疊。

原態情況下，抗體可能無法抓到 proteasome 內的 SP，要變性後再抓 (參考 D2, D6)。

R2

第二次作的 anti-SP pAb 能產生明顯的沈澱線 (上圖)。

R3

HX 雙向擴散有 spur 出現，但 SP 混合 proteasome 則無，顯示 HX 可能由兩者所結合。

R4

組織切片結果顯示，SP 的含量比 proteasome 多，兩者分布的位置類似。

D1

利用不同 pH 電泳溶離緩衝液純化 HX，探討 pH 對 HX 的影響 如何。

*

D2

製備式電泳後，應以活染結果決定切割那一部份膠片。

但是注意與 proteasome 結合的 SP 可能測不到活性 (參考下面 D6)。

D3

論文中需有一張綜合圖解，詳細描述各純化過程中的 HX，並確定 HX 的定義範圍。

*

D4

腹水可能含 proteases，須嚴格保存於 -20℃，避免回溫降解。

*

D5

Double diffusion 需測定蛋白質量，並可重複再做一次。 而利用 double diffusion 測試 anti-SP pAb 效價時，抗體可以不同稀釋濃度放在周圍。

D6

電泳只用一種樣本 HX 時，轉印後以斜角 15 度平行切成長條狀，各條利用不同變性方法，再分別以不同抗體染色，以精確比對出原態電泳中的 proteasome 中是否含 SP。

1

D7

甘藷切片加熱 45℃處理後，先以電泳觀察 SP 的降解情形後，再利用 anti-L1, anti-L2, J3b, H7c 等抗體去進行組織免疫染色。

1

D8

暫停有關 chaperonin 的實驗，全力進行 proteaseome 的相關實驗。

工具與方法大致就緒，因該趁勢進入研究主題，以 confocal 顯微觀察證實假設。

研究主題除了探討 SP 與 proteasome 的連結關係之外，也可延伸到其他問題。

021113  進度報告答問錄  曾光靖 (1) 

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [TKC 021113.ppt] 要密碼

  Sp806 在 minimum medium 下不產生金屬光澤

R1

Sp2476 (Regular), Sp2476 (Minimum) 在鎘濾紙條實驗中都產生有金屬光澤，但 Sp2476 (M) 的金屬光澤有別於 Sp806 (R) 及 Sp2476 (R)；而 Sp806 (M) 則無金屬光澤產生。

R2

Sp2476 (R) 粗抽液的檢測結果似乎與 Sp806(R) 相似：都可偵測到一些 SH group 及 S₂^-，S₂^- : Sp2476 (R) 與 Sp806 (R) 量差不多，但 SH group : Sp2476 (R) 小於 Sp806(R) 量。 AA scale 資料雖然看似誤差，不過這誤差也有一點類似 Sp806 (R) 的趨勢。

F1

再確定 Sp2476 (R) 及 Sp2476 (M) 菌體外是否有鎘結合蛋白質的存在。

F2

探索 medium 的差異如何影響金屬光澤的表現情形。

可以試著在 minimum medium 中補足 Typ, His, Met，看結果與 rich medium 有何差別。

 1

色析法管柱要全程跑完，並在圖上註明所有重要條件。

菌體清洗後要測定有無鎘含量，以便確定金屬光澤區含有鎘。

要以未加鎘的控制組比對；蛋白質量都要增加。

再確定於 minimum 條件下的金屬光澤產生情形。

詳查 Sp806 與 Sp2476 兩株菌的遺傳背景。

要注意實驗的再現性，並且得到精確的測量結果，才能放心去推斷可能的機制。

所要追求的題目及目標已經浮現，應該策劃如何達到預期目標。

021113  進度報告答問錄  葉昭圻 (1) 

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [YCC021113.ppt] 要密碼

  不同的加熱情形有降解差異

蛋白脢的活性測定方法無法得到線性關係，但在色析法分析溶離液時可大致看出。

重複塊根 45C 加熱實驗，發現仍在 30 h 後降解，但若不切片則不降解 (上圖 30B)。

也只是初步實驗，蛋白脢的部份暫時擱置，以塊根的降解為主要探討題目。

降解實驗操作要重複多次看再現性如何，然後切入主題： 溫度是否為降解信息？

 1

021030  進度報告答問錄  駱亭 (1) 

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LT021030進度報告1.ppt] 要密碼

  布袋蓮不加培養液後無法產生 PC？

R1

已將實驗流程全部跑過一遍，但未發現 peak 2 (18 min)。

有點擔心 18 min peak 只是試管中的產物。

*

R2

經膠體過濾、離子交換後所純化的 HMW 進行脫鹽膠體過濾，反而產生 2 個 peaks。

R3

未加培養液，布袋蓮可能因營養不良，沒有產生 HMW 鎘複合體。

R4

追加培養液 7 天，仍未產生 HMV 鎘複合體，原因可能是加培養液時間不夠，布袋蓮營養狀況仍然不好；或是加鎘天數不夠。

或是培養液中的某種成份改變鎘的離子狀態，使得鎘可以被吸收進入植物體內。

*

D1

布袋蓮冬天不易生長，要以培養液渡過冬天，再來探討為何無法產生 HMW。

D2

在無添加培養液的情況下，無法產生 HMW 是否因為鎘的添加時間不夠長？

D3

看能否再大量生產 18 min peak 確定是否存在。

大四同學目前大都只能把實驗跑一次，熟悉實驗操作方法，其結果大多還無法判斷。

在布袋蓮不生長的期間，可用酵母菌練習，或者找一個酵母菌的小主題進行。

酵母菌好像在不同的培養基中也有不同的反應。

021023  進度報告答問錄  蔡雨靜 (1) 

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [ET20021023 進度報告一.ppt] 要密碼

  把竹筍分成上中下三段去檢測鎘的吸入量

要介紹實驗的前因後果，因此要有前言、結果討論，加上未來的工作方向。

對於鎘含量的單位要有一定的表示方式，應該要換算成總鎘含量。

實驗結果數據不足，沒有將所有的樣品做出，需要重新做。

只是初步實驗，因為有的採樣點沒有結果，因此無法判定竹筍有無吸收鎘離子。

有時間或等竹筍生長時期，再進行一次實驗；在此之前可加入吳裕仁的實驗小組。

 1

0201009  進度報告答問錄  吳裕仁 (1) 

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [921009(1)-wyr.ppt] 要密碼

  出土前後竹筍蛋白質體的變化。

R1

取不同生長時期的竹筍的樣本進行 pH 3~10 的二維電泳分析，蛋白質消長情形在膠片上不能很清楚的看出。

*

膠片應該在乾燥後再去掃描，會比較清楚。

R2

在進行完 pH 4~7 的二維電泳分析後，可以發現隨著竹筍的成長，竹筍內有一些蛋白質具有消長情形，將再比對確認具有消長的蛋白質位置。

R3

取不同生長期的竹筍樣本進行 SP 活性染色，發現 SP 的活性會隨著竹筍生長而逐漸減少，再經二維電泳分析後進行 SP 免疫染色，發現未出土竹筍樣品中有 SP 出現，而出土 60 cm 竹筍內則沒有 SP。

D1

在進行 2D 檢測時，每一種蛋白質樣品的定量必需準確。

1

D2

在進行 2D 比對時，必需找出一個 internal standard protein，以進行比對。

D3

確定完表現量有變化的蛋白質後，可進行 N-端定序或 MADL-TOF 樣品檢定。

1

D4

可以再進行 pH 7~10 的二維電泳分析，以觀察鹼性蛋白質的消長情形。

竹筍的蛋白質體不很複雜，擔心有很多都是看不到的膜蛋白，要小心詮釋結果。

有明顯差異的蛋白質點記錄下來，開始去水解定序，以鑑定其身分。

可用竹筍的蛋白質體為對象，嘗試製備出全部抗體，作為 Abome 的可能性實驗。

 1

021002  進度報告答問錄  王信傑 (6)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [WHC021002進度報告6.PPT] 要密碼

   確定 H6 的純化緩衝液條件及其抽出效率。

H6 的純化過程，更換適當 buffer 系統，以減少後續分析干擾。

*

應做一個濾紙條不加鎘的 control 實驗，以確定洗下的鎘非吸附性。

找出適當分析方法，以分析細胞外鎘結合物是否含 CdS。

PCS 抗體製備要小心篩選，應有實驗組與對照組相比較。

篩選順序應從 96 well plate 中利用 ELISA 篩出正反應株，再挑到 24 well plate 內培養，接著利用 Western blot 篩選，再進行 limiting dilution。

確定分離 H6 的緩衝液條件，但離子干擾仍然無法去除。

論文集中在 PCS 的催化機制探討，要先建立 (1) 大量純化 PCS; (2) 流暢的活性分析。

年底準備提 Prelim 口試，要把論文架構寫出，如何整合 H6 與 PCS？

020925  進度報告答問錄  楊光華  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [YGH020925.ppt] 要密碼

  以 Protein A 免疫沈澱 SPPK 並檢測其活性。

Superose 6 的 SPPK 活性分析取樣要更密，以便觀察是否有一個其他 peaks。

*

In-gel kinase assay 可嘗試以 L78 為基質，進行 native/SDS-PAGE 分析。

1

大量製備 mAb Y4W 及其他有用抗體之腹水，並對 SPPK 的專一性進行效價測試。

再仔細製作 SPPK 純化表，並統一訂定其活性單位。

進行 Anti-SPPK 之 Western blotting 分析 (儘快製備並且使用腹水)。

帶領研一進行 SP 與 AP 反應的實驗： 純化、活性、混成實驗 (reconstitute)。

純化表絕對不可忽視，單位及計算要嚴格檢查與控制，做出精確的 SPPK 純化表。

抗體應該無問題，但正式的腹水必須做出來，同時要小心保存單株化的細胞株。

L78 方面要請賴心屏配合純化與抗體製備，一起探討 SPPK 在 L78 上面的磷酸化。

020722  進度報告答問錄  廖珮秀 (3)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LPS_020722.ppt] 要密碼

多做幾次純化表，並由純化表的結果改進純化步驟。

設法改進 HPLC 的分離效果，以去除干擾 PC2 的 shoulder peak。

確定胺基酸組成分析結果中，面積百分比和莫爾濃度的關係。

改善蛋白質定量及免疫呈色的技巧，呈色過程或試劑是否有問題？

1

在 Pull-down 實驗中看不出 PCS 被帶下來 (上圖)，PCS 是否會與抗體結合而失活？

*

確認 12F9, 12C12 抗體代號的意義，並釐清是 IgG 或 IgM (注意所使用的二次抗體)。

*

真的無法確定 12F9 確實就是 PCS 的抗體，寄望在 PCS peptide 抗體的誘生。

把酵素純化做熟悉，大量製備，以便做動力學探討。

020715  進度報告答問錄  林怡岑 (3)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LYC-020715.ppt] 要密碼

增加雙向擴散的時間至三天，洋菜 (2%) 要加入抑菌劑 merthiolate。

1 

改善 Western 的呈色技巧，檢查呈色劑中 H₂O₂ 的含量與純度。

*

電泳只用一種樣本 HX，經轉印後切開，再分別以不同抗體呈色，可以精確比對。

通常兩種抗體不要混合使用，但因 HX 可能是 SP + proteasome，因此可以混合使用。

實驗必須重複幾次，以便確定結果及再現性。

利用暑假及空檔學習組織切片，以便得到 in vivo 結果。

注意各試劑間的最適當使用濃度，並且把各種技術磨練好，最終目標是組織定位。

雙向擴散應可成功，所用的抗體及方法，都可以應用在切片的組織定位上。

020708  進度報告答問錄  賴心屏 (3)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LSP(3)020708.ppt] 要密碼

確定 L78⁺ 的表現量，以 anti-L2, anti-(His)5 或 H7C 應該可以檢測得到 (上圖)。

以各種抗體來追蹤 L78⁺，但小心不要只 focus 在 His-tag 上。

*

以 Mono Q 純化 L78⁺ 的緩衝液用 pH 6.0 即可。

1

查出 L78⁺ 群殖株序列，在 C-端 His tag 前後的序列 (總共有 100 胺基酸 + His tag)。

抽出 L78⁺ 後可進行磷酸化分析，以 LC mass 或 TLC 檢定位置。

1

趕快 L78⁺ 確定的表現及抽取流程，得到大量 L78⁺ 後實驗才算正式開始。

論文的主要任務：以為 L78⁺ 基質，檢測 L78⁺ 上面磷酸化或蛋白脢降解的位置。

020617  進度報告答問錄  楊光華  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [YGH020617.ppt] 要密碼

甘藷塊根應有可對 SP 去磷酸化的 alkaline phosphatase (AP)。

1

要探討專一性，參考陳翰民從塊根中所抽出來的 phosphatase。

做純化表時，SPPK 活性單位的定義請仔細檢討，cpm 改為 dpm 單位計算。

*

上圖看來，AP 在  2 min 內就把 SP 的磷酸切除，再縮短 AP 去磷酸的時間。

預測是會有 phosphatase 的純在，以便連結成一個『磷酸化-去磷酸化』的調控網路。

SPPK 純化表要再仔細做過一次。

020527  進度報告答問錄  王信傑 (5)  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [WHC(5)020527.PPT] 要密碼

實驗必須定量。所有檢定要找一相同立足點 (如溼重或蛋白質量)，如此比較才有意義。

1

洗出酵母菌的含鎘物後，可再試洗第二次，看能否再洗出含鎘物質。

1

Area 1 界限要重新界定，以免與 Area 2 細胞混雜。

細胞外的鎘結合物 (金屬光澤) 確定是否為 CdS。

跑完 G15 後可再跑一次 G10，看溶離情形是否會改變，順便估計分子量。

粗抽所得鎘總含量，與 G15 溶離所得鎘量是否相符？ 請追蹤並估算。

1

大致確認上次報告所提出的問題 (020311)，應該是有把鎘溶離出來。

又再衍生出來的一些問題，都是有關定量的細節，非小心檢查不可。

類似的問題，如電顯照片的大小、處理前後比較等，都要在相對等條件下進行。

020520  進度報告答問錄  林俊毅 Fianl  上次報告

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LCY020520.ppt] 要密碼

晶片部份要以不同 citrinin 濃度做 sample 看最後呈色是否有抑制。

1

回收率部份要重作，並以 2 ppm 濃度之標準品作為外加 citrinin 濃度之標準。

1

其他綜合修正意見：

a) 卡通圖不要太複雜，要以讀者或聽眾的角度來作圖。

b) 實驗緣起及動機之解說，要配合圖解或說明文字，不能只是清唱。

c) 整個論文的動機只有一個：『建立一套快速檢測 citrinin 之免疫分析系統』。

d) 與 carrier 蛋白質之反應式要再確定，並查出 Mannich reaction 正確 反應方式。

e) 再斟酌解釋『競爭型間接式免疫分析法』的機制。

f) 各實驗結果旁邊，最好有卡通示意圖幫忙解說；或者實驗與結果可以放在一起。

g) 說明清楚何為 B/Bo，以及為何如此使用。

h) 實驗結果 12 可刪除，因各使用濃度當量不同，不應放在一起比較。

i) 可達致『改變 citrinin coating 濃度比改變一次抗體濃度對本系統影響較大』結論。

所有檢測應該要有極佳的再現性，請設計一個實驗，比較每日的再現性。

實際紅麴的應用也很重要，多設計幾個應用實驗，並且把晶片的預備實驗作好。

020513  進度報告答問錄  林怡岑 (2)

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LYC-020513.ppt] 要密碼

Double diffusion 的 buffer 改用 PBS (pH 7)，洋菜濃度改為 2%。

1

雙向擴散的 pH 可能影響 SP 與 proteasome 的結合程度，因此最好改成中性 pH。洋菜濃度則會影響沈澱線的形成，原來用 1% 可能太稀了。

雙向擴散後的清洗一定要完全，至少用 PBST 洗三天以上，並且勤換 PBST。

需減少抗原及抗體添加的次數，以減少誤判；請努力改進整套技術流程。

為了快速得到完整的 HX，可省略製備式電泳的純化步驟，管柱後直接使用。

如此所得到的 HX 純度並不好，但是用抗體的專一性去辨認，可以考慮犧牲純度。

雙向擴散時，抗原和抗體的莫耳當量須相等，否則無法產生沉澱線。

1

因此，抗原或抗體的添加量，不能太高或太低，通常要用實驗方法得知最適濃度。

所純化的 proteasome 及 HX 會不會互相污染？ 請仔細檢查。

*

獲得抗體後，以免疫轉印進行專一性確認時，要使用粗抽抗原，用均質抗原會誤導。

*

做這種實驗的重要關鍵： (1) 各種抗原或抗體工具作好、(2) 雙向擴散的技術操作好。

另一方面請快學習組織切片及染色技巧。 也忘了做整體的實驗流程圖。

020429  進度報告答問錄  廖珮秀 (2)

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LPS020426.PPT] 要密碼

抗體並非『變性』，可能是細胞株變化了。

*

PCS 的單株抗體一直有點問題，尤其這次『活性』與『免疫轉印』的結果分離開來，相當詭異 (上圖)。

管柱純化後的活性收集範圍宜再縮小，管柱要跑好。

1

相信這是同一件事，若管柱跑不好，收集的範圍就會很大，請一定要注意管柱操作細節。 每個純化步驟都要進行蛋白質電泳，並且開始整理出『酵素純化表』。

合成適當的 peptides 製作 PCS 抗體。

好像創撿也做過，但效價不好；可以重頭評估一下，與植物 PCS 比對，再選好合成序列。不管何種抗體，最好都用硫酸銨沈澱先部份純化出 IgG。

要確定 Sp806 在培養時 PCS 有被誘導出來。

1

都回到了『基本面』，把基礎的 PCS 誘導條件做精準 (4)，再把純化步驟及純化表作好 (2)，並且重新製備出可用的抗體 (3)。

忘了要整理出一張整體 實驗流程！

020415  進度報告答問錄  楊光華  

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [YGH020408.ppt] 要密碼

儘早進行 SPPK 純化表的製作．

1

回到最基本的重要事項，先把 SPPK 的純化作好。

SDS-PAGE 的 in-gel kinase assay 不成功的原因：

1

可能因為 L-SP 在 SDS 下失去正確構形，因此無法顯現 SPPK 活性。在 native-PAGE 實驗中可使用已加熱 (或加 SDS) 的失活 SP，注入電泳膠體中做為基質，看是否仍會有色帶出現。另外，native-PAGE 中 SPPK 位置過高 (上圖)，要加長電泳時間。

不要把純度不夠的蛋白質或抗體作為 ELISA 的第一層吸附物質，效果會很差。

使用 5'-AMP Sepharose 4B 進行純化時，可在緩衝液中添加金屬離子 (如鎂離子)，也許可以增加 SPPK 與 AMP 的結合能力。

趕快把純化做完整，得到純質 SPPK 後，進行所有的檢定或抗體製備都較方便。

所有同學在進行實驗報告時，也要整理出一份整體 實驗流程。

020325  進度報告答問錄  何子潔 → Final

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [BOX20020325.ppt] 要密碼

將粗抽取液進行硫酸銨分劃，以便純化 PCS。

1

抽取 PCS 時，布袋蓮樣本的量要增加。

PCS 活性分析後，收集 16 min peak 進行質譜儀分析看是否 PC₂。

1

繼續 PCS 的純化，採用此次所得到的條件：

(1)  新鮮採收樣本，馬上抽取。

(2)  使用加鎘三天後的布袋蓮。

(3)  使用液態氮均質。 

灰化結果，如有必要需再重做 (要做 duplicate)。

鎘的確由根部往上面送，但所轉運的量並不多 (上圖)，最後轉成 hmw complex。

放到無鎘環境後，布袋蓮的總鎘量稍降，可能是吸附在根部表面的鎘被洗掉。

020318  進度報告答問錄  賴心屏 (2)

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [LSP(2)020318.ppt] 要密碼

查出 host 之菌株是供表現用或是保存用。

1

記得把建構質體的資料找齊，將來要放入論文。

以 anti-(His)₆ Ab 做免疫呈色，應證表現蛋白確實含有 (His)₆。 

提高 binding buffer 體積，徹底洗淨 unbound 物質。

1

確定使用 100 mM imidazole 可以乾淨地流洗下 L78。

粗抽 buffer 加 detergent (Triton X)，確定 L78 確實溶出，而非形成 inclusion body 沈澱，確定表現量多寡。

1

重試 IPTG 誘導時間，取定菌量分上清及沈澱檢定。

隔一段時間要確定保存菌株是否正常。

選用小型 DEAE Sephacel 純化 L78 即可。 

可考慮使用 FPLC 較快速方便。

轉印時可再加一張 PVDF 膜，避免小分子蛋白質跑掉。

可再做一次熱處理，看能否簡化純化步驟。

L78 似乎還活著，請找好條件，準備大量製備，進行免疫及以下的磷酸化工作。

表現蛋白質除了 L78 外，共含有約 100 個胺基酸，因此可能要改名 (L78⁺)。

020311  進度報告答問錄  王信傑 (4)

Slide 位置: 520-1 > D > 2483 > Meeting Room > [WHC(4)020311.PPT] 要密碼

嘗試不同濃度粗抽 buffer，先對 G-15 分離後的 peak 做胺基酸組成分析，看有無 His。

1

若無法把 H6 溶出，則不可能以 G-15 分離得到正確的 peak，後者應含有大量 His。

以 SEM 確定粗抽取前後，細胞外的鎘結合物是否確實被抽出來。

*

鎘結合物是否沒進入 G-15 膠體內？ 可拿膠體上層去測鎘。

膠體過濾之 peak 到底是鎘結合物或是 free Cd 必須先確定。

若能得到抗原，以便製備抗體。

*

分子量太小，如何準備抗原？ 先用 anti-His tag Ab 抓抓看。

整個結果的重點是『H6 有沒有被抽取出來？』由電顯圖看 (上圖)，確有粒子產生。

要先解決此一問題，才能繼續後面的探討。