520 會議記錄

到生化社區： 簡 介  總值星  緊急反應  行事規章 ｜ 到共同儀器室 

Lab 520:  公佈欄｜磷解脢｜重金屬 ｜人員｜地圖｜行事曆｜分工｜前程設計｜畢業生｜ 回 520 研究室首頁

  2009 進度報告摘要

 5    黃 惠 敏   PCS 的結晶構造與細胞定位

Summary:

 1) 全長 AtPCS1 加了鎘的活性最高，接著是 AtPCS1 Y55E 加鎘，再來是 AtPCS1 Y55D 加鎘。

 2) 半長 AtPCS-N (加鎘與沒加鎘) 的活性沒有差異。AtPCS-N 活性最高接著是 Y55E 加鎘再來是 Y55D 加鎘。

 3) 沒有加鎘的半長 AtPCS-N 突變株幾乎都沒有活性。

 4) GSH substrate 濃度最高加到 30 mM。

 5) Localization 預測軟體預測 AtPCS1 會在粒線體以及細胞質裡的機率較高。

 6) 做了洋蔥表皮細胞的 GFP 暫時表現發現 AtPCS1 可能存在於細胞質中。

 7) 利用 PSIPRED 預測 AtPCS1 二級結構發現，AtPCS1 的結構非常 flexible 使得結晶不容易形成。

 8) AtPCS-N 蛋白質濃度高於 1 mg，會使得蛋白質沉澱，無法進行點晶。 

Future work:

 1) PCS 酵素動力學要做 Y55A。

 2) 進行 substrate reaction 時必須注意每一項藥品的濃度以及加的量

 3) 需了解預測軟體的原理，做 Dapi 染色標定細胞核以及打 pHBT-GFP vector 當 control 組。

 4) 找做過洋蔥表皮細胞的 GFP 暫時表的學長姐討論結果。

 5) 解決 AtPCS-N 蛋白質沉澱的問題。(注意 buffer 的 pH 值)

 6) 繼續試出能使 AtPCS1 結晶時間縮短以及提高產量的條件。

 時間表

 4    謝 瑩 貞   D-enzyme 與甘藷塊根澱粉充實的關係

 1) Pull down assay 及 far Western 的結果並不是很清楚，應改進實驗條件，並檢討哪些步驟可能發生錯誤。

 2) Pull down assay 的結果可能受到蛋白質後修飾影響，因此可先忽略表現蛋白質的部分。

 3) 樣品製備是實驗的關鍵，要控制好最重要的部分，也要注意電泳過程中蛋白質量不可過多，否則會影響實驗結果。

 4) 以 FPLC 觀察 HX 次單元組成之比例時，應確定 Western 所選取的分劃是否正確。

 5) 通常 gel filtration 定分子量的結果不大準確，只能做為參考。

 6) Blue native PAGE 應該補上 Western 結果，以確定 SP 及 DPE1 之位置。

 7) 若二維電泳的蛋白質量不夠，則可能影響定量結果。

 8) 利用離子交換法純化 SP 時，若以連續梯度分離蛋白質，效果可能較階段梯度好。

 9) 以酵素動力學觀察 SP、DPE1、HX 間的差異時，可利用加入不同的基質量。

10) 每次實驗後都要自我檢討，並做適度的改進。

 時間表

 4    劉 怡 君   禽流感病毒中 RNA polymerase 的抗體製備與交互蛋白質

 1) 抗體製備情形：PA 已取得單株抗體，進行腹水誘導大量製備，並初步確定其抗原決定基。PB1 及 PB2 只有抗血清，需盡快得到單株抗體。

  2) Fusion rate 不佳，需注意各細節，確實檢討可能的問題並改進。

 3) 經腹水製備的單株抗體濃度很高，若想要用競爭的方式確認抗原決定基，必須先試出最佳的作用條件與濃度，可用等倍稀釋的方式，多做幾種稀釋倍數的測試。

 4) 多株抗體的 Western blot 有非專一性結合的條帶，需改善實驗步驟，找到最佳條件。

 5) 使用 PA、PB1及PB2 的多株抗體，與經雞胚培養的病毒濃縮液進行初步免疫共沉澱，需注意病毒的蛋白是否有被打破而分離開來，可參考其它論文打破病毒的方式。

 6) 實驗步驟需好好設計，考慮各種情況 (設計好控制組) 以求實驗完整。

 7) 工具做好了，需要應用在科學探索上，並說出完整的故事。

Future work

 1) 儘快完成 PB1 和 PB2 單株抗體製備。

 2) 確認現有單株抗體之 epitope。

 3) 運用軟體先分析 epitope 於立體結構上之位置，或預測其他後修飾作用。

 4) 推測抗體之 epitope 對病毒之功能。

 5) 確認 2D-PAGE 上 PA, PB2 和 PB1 subunit 分佈。

 6) 運用現有抗體以 IP 方式初步分析 polymerase 各 subunits 間的 interaction。

 時間表

 4    黃 迺 茵   主題

 時間表

 1    林 歆 祐   PCS 的催化機制

 1    錢 思 翰   以流式細胞儀篩選差異性抗體庫

 1    施 驊 珊   斑馬魚卵發育過程的蛋白質體表現比較

 10   林 怡 岑   L-SP 分子上 L78 之降解受到溫度與 proteasome 的控制

實驗結果：

    將甘藷塊根切片進行 45ºC 加熱處理後，隨著時間累積，L-SP 有階段性降解的現象，目前推測 first cutting site 在 PEST motif 上，並由 proteasome 機制降解 L78，此結果可能改變 L-SP 的生理活性，由合成澱粉轉為磷解澱粉，產生 Glc-1-P，進而促進 NADPH 生成，來減少因熱逆境產生 ROS 所造成的細胞傷害。

建議事項：

 1) 問問看張老師有沒有 19S regulator 之 antibody，利用 19S regulator antibody 進行 Western，觀察 19S regulator 是否存在，雖然之前利用 LC/MS/MS 都沒有發現，而且目前也發現一些 proteasome 降解機制不需要 19S regulator 參與。

 2) 將 45ºC 加熱處理不同時間之 L-SP 降解片段進行 N-端定序，看看斷裂的機制是否符合 Belizario et al. Curr Protein Pept Sci. (2008) 9(3): 210-220 所提出的，先由 caspase 切一刀後，再經由 20S proteasome 降解之機制。

 3) Caspase 專一性切位是什麼？主要是切 Asp 的 C-端；而 Belizario et al., 2008 則提出 caspase 會辨認 PEST motif 並降解之。

 4) 植物中含有 caspase 嗎？它與細胞凋亡及其他很多調控作用很有關係，查看植物中 caspase 的相關研究。

 5) Confocal images 都是用同一條件去照射的嗎？ 是的，相同強度，相同時間。

 6) 目前推測整個機制的 trigger 是 heat shock，L-SP 受熱開始經由 proteasome 路徑降解，cutting site 在 PEST 上，L78 去除後，L-SP 傾向磷解澱粉產生 Glc-1-P，然後呼應 Zeeman et al. Plant Physiology (2004) 135: 849-858 所提出，Glc-1-P 可能進而促進 NADPH 生成，來減少 ROS 所造成的細胞傷害。如果真是如此，我們可以追蹤這條路徑？

 7) 看看陳翰民博士的論文中，L-SP 的切點為何？能不能符合 caspase 的切位？

 8) 加熱到 32 h 後切片還容易嗎？ 有沒有糊化？Confocal images 要附相對之光學顯微鏡 images。

 9) 查閱 gelatinization 和 heat shock 有沒有關係？ Gelatinization 是我們很早就觀察到的現象，可以從中查到更多的文獻，看看植物中澱粉 gelatinization 代表什麼？

10) Kinetics 作了幾次？ 要記得加 error bar。 L-SP 磷解方向測 Glc-1-P 生成，反應好不好作？要用耦合反應。

11) MG132 看來的確可以抑制 L-SP 降解，但無法觀察到 L-SP 有 ubiquitination 現象。

12) 有沒有什麼方法可以證明 L78 進入 20S proteasome (DM) 的活性口袋？

13) 45ºC 加熱處理可以再做久一點，看看 L-SP 到最後會如何？

14) 生理情況下會發生連續 24 h 以上 45ºC 的高溫嗎？ 我們的實驗算是放大整個逆境的訊號，來觀察整個 pathway，在生理上，可能不需要那麼長的時間，在甘藷塊根表面上的一些細胞就開始發生這些作用。

未來工作：

 1) 利用 N-端定序找出 45ºC 加熱處理後，L-SP 的第一個斷裂點。

 2) 將 L78 上面的幾個斷裂點胺基酸進行 point mutation，看看降解現象是否會有差異。

 3) 另外，可買 caspase 來試試，看能不能切 L-SP 的 PEST motif，然後搭配純化 20S proteasome，模擬整個降解機制。

 4) Heat shock, caspase, proteasome, L-SP 以及 gelatinization，找出它們之間的關連性。

 時間表

 6   賈 儒 珍   主題

 時間表

 1    沈 志 昱   母源轉換到胚源的標誌蛋白質及其抗體製備

 3    謝 瑩 貞   D-enzyme 與甘藷塊根澱粉充實的關係

 1) 由於 Far Western 結果不是非常明確，應改進實驗條件以提升訊號強度，或利用其他方法來觀察 L-SP 與 D-enzyme 之作用情形。

 2) 評估是否可利用綠藻 (515) 研究 L-SP 與 D-enzyme 間之交互作用或生理意義。

 3) 利用相同來源，不同大小的甘藷塊根以表示各階段的澱粉充實程度，觀察其中 L-SP 與 D-enzyme 之含量，並進一步探討蛋白質在不同生長階段的重要性。

 4) 進行原態電泳時，可延長電泳的時間，以利高分子量的蛋白質分開。

 5) 實驗前應先想好研究動機，並加強實驗結果的呈現。講者必須站在聽眾的角度，以說故事的方式描述實驗目的及結果之含意。標題應明確顯示該實驗之意義與重點，使聽眾能一目了然。

 6) 應設計其他實驗方法，進一步探討 D-enzyme 與 L-SP 之作用，在植物生理上是否有重要的影響？多看論文多與別人討論，可以啟發對研究的新想法，有利於尋找實驗的動機。

 時間表

 3    劉 怡 君   RNA polymerase 在 AIV 感染過程的角色

 1) 使用兩株本土禽流感病毒 (台大獸醫系王金和) A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1)；A/chicken/Taiwan/2838N/00 (H6N1)

 2) 目前已得到可分泌 PA 單株抗體之細胞株，將繼續放大繼代，盡速取得純化抗體。

 3) PB1 及 PB2 的單株抗體仍在製備中。

 4) 可先與不同時期經病毒感染的宿主細胞進行免液共沉澱 (IP)，確認抗體確實可抓到宿主細胞株內的病毒 RNA 聚合酶，並儘快取得初步結果。

 5) 比較不同時期經病毒感染的宿主細胞 2-DE 圖譜上蛋白質點是否有差異，若存在差異則以 mass 鑑定身分。

 6) 定義『不同感染時期』，參考文獻看看是否有 maker protein 或 marker gene。

 7) 確認抗體染色的位置是否具有特殊意義。

 8) 使用共軛焦顯微鏡與免疫螢光染色，直接觀察三種 RNA 聚合酶於宿主細胞內組裝的過程。

 時間表

 3    黃 迺 茵   阿拉伯芥的 PCS 突變株及點突變 PCS 構築

 1) 由於 DNA 最後的產物是蛋白質，所以也可以直接用抗體去偵測 PCS 的表現量，但是阿拉伯芥中的 PCS 量是否足以被抗體抓到，且專一性如何，這需要進一步實驗證實。

 2) 雖然 Cad1-3 是已經發表的突變株，還是要再次確認它的酵素活性和性狀，最好可以重現 paper 內的性狀。

 3) 要注意實驗進度，最好連點突變株的載體一起構築，自己要抓緊時間 (2009/12/31 的目標？)。

 4) 由於植物轉殖等待收種子的時間很長，這期間可以進行其他實驗，例如測試點突變表現蛋白質的性狀，或是純化內生性的 PCS 等。若 in vitro 的性狀跟預期不符合，則無法做到 in vivo。

 時間表

 5    黃 惠 敏   PCS 的結晶構造與細胞定位

 1) 目前所結出來的晶體因太小無法進行 X-ray 繞射。

 2) 結晶 buffer 的 pH 值以 0.1 進行微調。

 3) 使用不同溫度：25ºC / 10ºC / 4ºC

 4) 微調後晶體 buffer：0.1 M Zinc sulphate heptahydrate, 25% w/v PEG 550,  0.1 M MES, pH 6.9 (4ºC)。

 5) 晶體由三個月的生長時間縮短至兩週。

 6) 因  cold room 震動太大，會影響晶體的結構以及形成時間。

 7) 使用 PSIPRED (UCL) 模擬 PCS 二級結構發現：PCS 結構有許多 flexible area，因此造成晶體形成困難。

 8) PCS 進行 GFP 細胞定位實驗：探討 PC 合成的位置，了解重金屬在進入細胞後能被捕捉的位置。

 9) 已的完成 pHBT-PCS-GFP 的 cloning。

Future Work:

 1) 結晶找到更快速生長條件，未來需要進一步找出使結晶變大的條件。

 2) 進行 pHBT-PCS-GFP 的洋蔥表皮細胞內表現。

 時間表

 Y   羅 庭 芳   禽流感病毒 H1 isoforms 上面的醣化現象

summary

 9   林 怡 岑   L78 影響 L-SP 之降解與催化活性

實驗結果：

 1) L-SP 在不同甘藷塊根生長時期，其分子上的 L78 並不會斷裂，但是將甘藷塊根切片進行 45°C 加熱處理後，發現隨著時間的累積，L-SP 有階段性降解的現象，此結果顯示 proteasome 所造成的 L78 降解，可能改變 L-SP 的生理催化活性，由合成澱粉轉為磷解澱粉，產生 Glc-1-P 來抵抗熱逆境。

 2) L-SP 與 D-enzyme 之蛋白質含量都隨著甘藷塊根的生長而增加，並且在成熟甘藷塊根中，兩者互相結合的現象最為明顯，此結果顯示這兩種蛋白質可能在成熟甘藷塊根中，以 protein complex 的形式進行 MOS 的回收與重新利用。

建議事項：

 1) 阿拉伯芥葉片並不適合用來觀察澱粉是否累積之表型，因為其為 source tissue，所累積的是暫存性澱粉。

 2) Satoh et al. The Plant Cell (2008) 20: 1833-1849 中，是如何推論 L-SP 與 primer initiation 有關？

 3) 加熱處理之甘藷塊根可進行冷凍切片之 confocal microscopy，另外，加熱時間可延長至 36 hr。

 4) 觀察甘藷塊根不同生長時期之 L-SP 含量變化，可分為固定蛋白質總量與固定 fresh weight 兩種方式來比較。

 5) Review Satoh et al. The Plant Cell (2008) 20: 1833-1849 與 Tetlow et al. Plant Physiology (2008) 146: 1878-1891 之文獻。

 6) 利用生物資訊學比較不同物種 L-SP 之序列 (尤其是會累積澱粉的物種)，可由這些資訊獲得一些 information and new ideas。

 7) 由初步的 ubiquitination 實驗，無法斷定 L-SP 是否受到 ubiquitination 之修飾，因為 ubiquitination 之蛋白質可能很快就被降解而不易觀察，而 MG132 的抑制效果也有限。

 8) 將古生菌 20S proteasome deletion mutant (DM) 造成 L-SP 斷裂的 F50s 片段進行 N 端定序，可得知 major cutting site 為何，此實驗結果可與陳翰民 (1997) 之實驗結果作比較。

 9) L-SP 與 HX 對於 soluble starch 之 K_m 值比較，並不具重大意義。

10) E. coli 中的 MalP 比較類似植物中的 L-SP 還是 H-SP？

Ans：E. coli 有兩種 phosphorylase，分別為 MalP 和 GlgP，兩種 phosphorylase 的分子序列中均不含類似 L78 之序列。

11) 應比較 E. coli 中 MalP 和 GlgP 與馬鈴薯或其他物種中 L-SP 和 H-SP 的相似度。

12) Glucan trimming model 中有說明 maltotriose 會累積嗎？

Ans：Myers et al. (2000) Recent progress toward understanding biosynthesis of the amylopectin crystal. Plant Physiol 122: 989-997 中推測 maltooligosaccharides (MOS) 會累積。

13) 陳翰民 (1997) 有比較過完整的 L-SP 與斷裂的 L-SP 對於澱粉的親和力改變，但並未比較過對於 MOS 的親和力改變，可參考此實驗，比較完整的 L-SP 和斷裂的 L-SP 對於 MOS 的親和力改變。

14) 有 paper 提出 L-SP 和 D-enzyme 會形成 protein complex 嗎？

Ans：沒有，目前科學家只推測此兩種蛋白質所進行的是連續性的反應。

15) 參考 Tetlow et al. Plant Physiology (2008) 146: 1878-1891 所進行的實驗，設計關於 protein-protein interaction 之相關實驗。

16) Confocal 實驗中 L-SP 和 D-enzyme 的 merge 結果相似度太高，可調整抗體濃度或其他條件來改善。

17) Confocal 實驗中 L-SP、proteasome 和 D-enzyme 都位於 amyloplast 中，位置都很相近，有沒有可能這三種蛋白質互相結合？可進行 proteasome 和 D-enzyme 之 confocal 實驗，觀察兩者是否有 co-localization 之現象。

18) L-SP 和 proteasome 互相結合，可是 L78 卻依然存在，此現象如何解釋？

19) 論文中需詳加敘述關於 E. coli 中 malP (L-SP) 和 malQ (D-enzyme) 的關係，因為那是整個故事的起源。

20) 是否嘗試過將 L-SP 和 D-enzyme 在試管中混合？

Ans：有，但結合力很弱，無法明顯觀察到。

21) 由 GST pull-down assay 的結果推測 crude extract 中，可能有 something 幫助 L-SP 和 D-enzyme 結合，或是 L-SP 受到某種後修飾調控。

22) 關於 L-SP、proteasome 和 D-enzyme 這三個蛋白質的關係，你打算怎麼解釋？  

Ans：希望能分別進行探討。

未來工作：

 1) 未來方向需著重兩個蛋白質互相結合之生理意義，以及結合的 mechanism，例如為何需要 proteasome？proteasome 如何調控 L78 降解？以及 L-SP 與 D-enzyme 之 pathway 等。

 2) 以寫 paper 的心態開始整理 data，一篇 paper 大概需要七個圖與幾張表，每張圖要能說明一個故事。

 時間表

 5   賈 儒 珍   主題

 時間表

 12   何 杰 龍   主題

 時間表

 2    謝 瑩 貞   SP 與 D-enzyme 的蛋白質交互作用

 1) SP 的粗抽液與硫酸銨一起沉澱下來，如此的蛋白質可以在 -20°C 儲存。

 2) 引用別人的 slide 須標明來源。

 3) 跑電泳時，每個 well 必須加入同樣的蛋白質量，且避免蛋白質過多，影響結果的可信度，每張 slide 上必須註明跑電泳時所加入的蛋白質量。

 4)  XT 請以『粗抽液』表示。

 5) SPN 與 SPC 非全長，其構型可能無法摺疊完全，因此可能影響與 D-enzyme 的結合力。

 6) 應聚焦思考蛋白質交互作用可能的生理意義，並著重於整體澱粉生理上的研究。

 7) 由於 SPN 與 SPC 表現的蛋白量太少，且 pull-down assay 結果產生許多非專一性訊號，未來將改用 Far Western 觀察在植物體中 SP 和 D-enzyme 之間的關係。

 8) 利用不同生長時期的 SP 粗抽液，和不同純化階段的 SP 進行 Far Western，並加上 anti D-enzyme 當對照組，以利分別內生蛋白質與 D-enzyme 表現蛋白，並控制相同的曝光時間進行 ECL 呈色 。

 9) 應徹底了解 SP 與 D-enzyme 的生理功能與其參與澱粉代謝的目的。

10)可將不同 anti-SP 的單株抗體混合使用，取代傳統性血清。

11)利用 BiFC 進行 in vivo analysis。

 時間表

 2    劉 怡 君   製備 AIV 病毒蛋白 PA 及 PB2 單株抗體

 1) 使用 2 株本土禽流感病毒 (台大獸醫系王金和老師提供) A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1)；A/chicken/Taiwan/2838N/00 (H6N1)。

 2) 深入了解研究 PA & PB2 的目的，製備 PA & PB2 mAb 有何作用？ 以科學研究目的領導實驗方向。

 3) 已將免疫後的小鼠 fusion，得到 PA及 PB2 的 anti-serum。

 4) 使用 PA 及 PB2 anti-serum，嘗試定位兩種蛋白質於 2-DE 上位置。

 5) 比對用來免疫的 peptide 位於蛋白質立體結構上的位置，找出其應用的生理意義與功能。

 6) 利用 pGEX-4T-1 vector construct PAR, PB2R 及 PB2F；也嘗試利用 2-DE 電泳分開兩種蛋白質，希望得到獨立的蛋白質後，進行 Far Western。

 7) 因為同時擁有 PA 及 PB2 的 anti-serum，因此可能朝向 binding site 或是 protein-protein interaction 的方向搜尋。

 時間表

 2    黃 迺 茵   PCS 在阿拉伯芥中的表現與調控

 1) 已經篩到 homozygote。有研究顯示出，PCS 基因缺失會造成阿拉伯芥在面臨鎘逆境時無法合成 PC，外觀上葉片呈現萎黃狀，且根部會有明現的褐色色素沉澱。

 2) 應設計好 cadmium tolerance 的分析方法，比較的組別有哪些 (例如 PCS-null, PCS-point mutant 和 WT 在鎘處理下的根長度會因鎘耐受性之不同而有差異)。

 3) 應釐清實驗的主軸是什麼 ? 目的是什麼 ? 並學習以有條理的方式表達。

 時間表

 4    黃 惠 敏   Phytochelatin synthase 的分子結構分析

 1) 氯化鎘處理過後的 AtPCS1 在蛋白質與結晶液體 1:1 的比例下可形成結晶。

 2) Total protein 濃度 8 mg/mL

 3) 結晶 buffer: 0.01 M zinc sulphate heptahydrate; 0.1 M MES monohydrate, pH 6.5; polyethylene glycol monomethyl ether 5500 (PEG 5500)

Future work:

 1) 增加晶體的體積。

 2) 縮短結晶生長的時間。

 3) 找出 AtPCS-N 與 AtPCS-C 的結晶條件。

 4) 將 PCS-GFP 表現於洋蔥表皮及阿拉伯芥原生質體細胞，藉以觀察細胞中位置。

 時間表

 4    羅 庭 芳   AIV 上 HA1 的醣類修飾

 1) 使用 2 株本土禽流感病毒 (台大獸醫系王金和老師提供) A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1)；A/chicken/Taiwan/2838N/00 (H6N1)

 2) 2838V 由 2838N 突變而來，HA 突變率 1.41% 共有八個突變位，兩者 HA1 peptides 相差三個 charge。

 3) Lectin blot 結果直接證明 HA1 上有 a2-3 linkage 之 sialic acid。

 4) 使用 MALDI-TOF/TOF MS 比較各 HA1 isoforms 之醣質差異，可發現等電點越低，也就是越酸之 HA1，其 m/z 1867.2 之醣鏈含量比例越高。

 5) 未來將繼續以 MS 檢定 HA1 上面的 N-linked glycans。

 時間表

 4   林 之 儀   L-SP 的 PI 催化活性機制

結果摘要︰

 1) 繼續進行 HPAEC，注意其結果需有再現性。

 2) Glc-1-P 的 peak 可能擋住五醣及六醣，將使用 BaCl₂ 沉澱法嘗試去除。

 3) 是否能將 injection volume 增大，把 HPAEC 的圖譜做漂亮一點。

 4) 做長時間反應，測定活性的時間不能太長，否則會影響結果的可性度。

 5) 每一張圖都應該要有 error bar。

 6) 跑 IEX column 時要確定膠體已平衡完全，並且在一開始流洗時，就要收集 unbound 部份。

 7) 反應產物可以用代謝體學專用的小分子 LC/MS/MS 分析。

未來工作︰

 1) 以 GC/MS 或 LC/MS/MS 來分析 L-SP 反應之產物。

 2) 繼續進行 HPAEC，並加入 phosphate 為標準品，以得知反應後 phosphate 在圖譜之位置。

 3) 使用 galactose 做為基質，看其合成是否與 phosphate 有關。

 4) 進行 H-SP 之純化，並進行其 PI activity 分析。

 時間表

 5    眭 毓 庭   PCS 的活性機制探討

 1) PhosPRO phosphoprotein purification kit 純化到的是阿拉伯芥中所有磷酸化蛋白質，其中只有部分為磷酸化 PCS，需用 2D 電泳才能真正分析磷酸化前後抗體 C7a 的辨識狀況。

 2) 必須留下純化前的樣本一起跑電泳及 Western blot，且蛋白質要定量跑電泳，比較其消長變化才有根據。

 3) Activity assay 應該用相同的莫耳濃度來比較，而非以相同的蛋白質量。

 4) Activity assay 中沒有加 Cd²⁺ 的對照組，應添加 EDTA。

 5) 將所有現有的突變株，包括 Y55A、Y55E、Y55D 都一起來做活性分析。

 6) 可以考慮再做 Y55H，預測活性應該會更強。

 時間表

 8    林 怡 岑   澱粉磷解脢 L-SP 與其他酵素的交互作用

 1) In vitro degradation assay 可與張老師實驗室合作，設計實驗比較 20S proteasome wild type 與 deletion mutation 降解 L-SP 之差異性。

 2) 利用 anti-ubiquitin Ab 偵測粗抽液中，L-SP 是否有 ubiquitination 的現象。

 3) 購買連結螢光之 anti-IgM Ab 以偵測 J3b。

 4) 比較直徑小於 5 mm 與大於 50 mm 之甘藷塊根中，L-SP 與 proteasome 之組織定位圖。

 5) 利用 anti-L1 pAb 進行組織免疫螢光染色，觀察 L-SP 在不同時間之 45°C 加熱切片中，是否有階段性降解的現象。

 6) HPLC 圖譜中，為何 maltotriose 以上之寡糖標準品，都會分裂為兩個 peaks？

A) 可能是 a 與 b form。

 7) 在給予 maltotriose 為基質的情況下，L-SP 與 D-enzyme 之酵素反應會產生 maltose 嗎？

A) 可能有雜蛋白污染 (例如 b-amylase)。

 8) Anti-20S proteasome 抗體是兔子傳統性血清，如何確認其是否具有專一性？

A) 目前已用甘藷塊根粗抽液之全蛋白質來進行 Western，結果只偵測到一條 proteasome 色帶，無其他蛋白質色帶出現，故此抗體應具有專一性；另外也可進行免疫沉澱法，將所有沉澱之蛋白質進行 LC-MS/MS。

 9) Proteasome 或 D-enzyme 在甘藷塊根中，蛋白質含量應該沒有 L-SP 多，為何螢光訊號那麼強？

A) 由於抗體有單株、多株的差異，以及二抗或 biotin-avidin 放大訊號程度不同等問題，使得我們無法從螢光訊號強弱，來觀察蛋白質的實際含量差異。

10) Confocal microscopy 螢光訊號重疊之實驗結果能直接證明兩個蛋白質互相結合嗎？

A) 由於放大倍率不足，螢光訊號重疊只能說明兩個蛋白質有 co-localization 的現象，還需配合其他蛋白質互相結合之實驗結果，才能推論兩個蛋白質互相結合。

11) 可進行 yeast two-hybrid 來佐證蛋白質之間的結合關係。

12) 一般 proteasome 大多位於細胞的哪一部分？

A) 有 paper 顯示在細胞質、細胞核以及造粉體中都有發現。

13) 為何 HX 是 L-SP 加 proteasome，也是 L-SP 加 D-enzyme？

A) 目前推測 HX 中可能含有不只一種形式之蛋白質複合體，而由原態電泳圖中，的確可觀察到多條 L-SP 高分子量活性色帶。

14) 在 L-SP 之 primer independent mechanism 中，D-enzyme 可能扮演的角色為何？

A) 假若 L-SP 無法將形成的 primer 釋放出，D-enzyme 可能進行糖分解反應，幫助 primer 釋放，或者當 L-SP 延長 primer 到 maltotriose 時，交給 D-enzyme 進行後續的糖鏈延長作用。

 時間表

 1    報 告 者   主題

 時間表