520 會議記錄

到生化社區： 簡 介  總值星  緊急反應  行事規章 ｜ 到共同儀器室 

Lab 520:  公佈欄｜磷解脢｜重金屬 ｜人員｜地圖｜行事曆｜分工｜前程設計｜畢業生｜ 回 520 研究室首頁

進度報告摘要

 1   陳 又 楷   B2m 蛋白質的純化與 2-DE 檢定

(1) 為何二維分析結果無法呈現 B2m 之正確 pattern？

     由於 Western blotting 結果尚未穩定，多次實驗皆未觀察到 B2m 之連續位點分布，需改善抗體濃度及反應時間，增加實驗操作熟練度。另外，直接電泳分析血漿樣本，觀察 CBR staining 和 Western blotting 結果並比較高產及低產豬差異。

(2) 免疫沉澱之原理及步驟如何？

     利用抗體和抗原間專一性結合，自樣品中純化出目標蛋白質。是將抗體架接於磁珠，加入樣本並洗去雜蛋白，溶離後得到目標蛋白質。

(3) 目前免疫沉澱之結果？

     由於抗體與磁珠架接效果不佳，溶離時抗體與 B2m 一起脫落，Western blotting 出現 3 個明顯訊號 (75 kDa, 50 kDa, 25 kDa)，應為抗體及其斷片，遮蔽 B2m 位點。改善方法為：提高抗體濃度和延長架接時間，增加清洗次數以減少非專一性結合。 

Future work:

     完成生產預測實驗，並進行 B2m 定序，探討位點 1 和位點 2 的後修飾差異，以及其所代表的意義。

     B2m 的分離一定要做好，並且有再現性。因此，親和層析的步驟必須仔細檢討，找出純化的最佳條件。

 時間表  

 1   蔡 政 宏    Pho1-DPE1 複合體中澱粉磷解酶與 D-酵素之轉譯後修飾 

進度摘要：

(1) 將甘藷粗抽以膠體過濾分離之後，分別以 H7c 及 Y1f 抗體進行免疫呈色，決定 HMW 及 LMW 所在的分劃。

(2) 將 HMW 及 LMW 分別進行 2-DE，分析其圖譜差異。(未成功)

問答集：

(1) 3 次都使用硫酸銨分劃？ 硫酸銨分劃不穩定的原因？

 A 只有第二次採用。 不穩定的原因可能是 protein 樣本的量沒有固定，但可能還有其他未知的因素。

(2) 2-DE 未能成功的原因？

 A 在將蛋白質定量後再進行濃縮回溶的步驟，可能過程中會導致蛋白質流失。而且在選取 HMW 及 LMW 的樣本時，選取單一 fraction 本身蛋白質量就不多，不容易看到訊號。 

(3) HMW 及 LMW 之定義？

  A HMW 為 SP 與 DPE1 形成的 complex，而 LMW 則是 SP 及 DPE1 在細胞中的 native form。 

(4) 原本 2-DE 預期看到什麼樣的結果？

  A 預期應該會在同一個分子量看到依 pI 值分離之不同的點，證實有磷酸化的現象。 

(5) 還要繼續使用硫酸銨沉澱法嗎？

  A 暫時先以濃縮管進行樣本濃縮的步驟。 (注意粗抽取液很容易把濃縮管阻塞！)

(6) DPE1 和 SP 形成 complex 之機制？ 實驗設計的理由？

  A DPE1 與 SP 可能是藉由磷酸化的方式形成 complex，因此實驗設計便是要證明 HMW 的蛋白質有磷酸化，LMW 則沒有磷酸化。接下來再證明將磷酸化的 HMW 利用去磷酸酶除去磷酸化之後，是否會恢復為 native form，便可證明磷酸化對形成 complex 是必須的。

 (7) 如何直接證明蛋白質受到磷酸化？

  A 可以用 Pro-Q Diamond staining。 

建 議：

     活性染色解析力不足，可試採用梯度膠體電泳將 β-amylase 及 Pho1-DPE1 complex 分開，避免 β-amylase 干擾。 

結 論：

(1) 濃縮後先定量蛋白質，再進行膠體過濾，找尋最適合 HMW 及 LMW 分離的濃度。

(2) 先證實 Pho1 及 DPE1 會受到磷酸化。

(3) 要更加熟練實驗技術。

 時間表  

 1   賴 欣 妤   追蹤 IFGBP3 以預測母豬之生產率 

  1) 應介紹使用 IGFBP3 做為研究主題的緣起。

  2) 調整 ppt 的順序，以增加報告的通順度。

  3) 加入一張整理表格，包含 IGF-1, IGF-2, IGFBP3 的功能及特性。

  4) 了解 IGFs, IGFBPs 的作用機制。

  5) 要搭配參考 paper 的圖表較能說明 paper 內的觀點。

  6) 是否要對 IGF-1, IGF-2 進行實驗。

  7) 東海所做的抗體 (IGFBP3)，是用哪一段 peptide 或是用 protein做 出來的？

  8) 確認 IGFBP3 的抗體是否正確。

Comments:

除了對報告的方法與指正之外，應該多加強對研究內容的討論 (研究目標、方法、規劃等)

 時間表  

 1   胡 景 涵   搜尋癌幹細胞表面的標誌蛋白 

 1) 要說明清楚為何要做此實驗，實驗目標要說明清楚。

 2) 每張圖要講清楚重點為何，尤其是實驗重點的圖，要將內容弄懂。

 3) 找出 ABC-transporter 之保守性序列及其保守性。 (此 ABC 與下面的 ABC 不同)

 4) 問清楚 ABC (avidin-biotin complex kit) 之價錢，可以用 ABC system 增加偵測靈敏度。

 5) IEF, electrophoresis 直接以 2DE 表達。

 6) 投影片之英文文法及報告時口頭禪要改善。

Comments:

除了對報告的方法與指正之外，應該多加強對研究內容的討論 (研究目標、方法、規劃等)

 時間表  

 1   陳 怡 靜   PCS kinase purification and assay methods 

兩個取代放射線以觀察磷酸化蛋白質的方法:

(1) Pro-Q Diamond stain kit

     此方法可以將磷酸化的蛋白質偵測出來，一開始經過 Pro-Q Diamond stain 進行染色後來經過 excitation/emission visible-light scanning instrument 觀察是否有磷酸化蛋白質的存在，可使用於 SDS-PAGE 以及 2D gel。此產品和 SYPRO Ruby dye 並用，可以進行蛋白質的定量，更加了解蛋白質磷酸化的情形。

(2) Phos-tag

     此新技術 2010 年由日本 Wako 公司研發，利用金屬離子 (Mn2+) 和 polyacrylamide 的鍵結，可以和磷酸化的蛋白質結合，不同的金屬濃度可以使磷酸化的蛋白質分離的更加明顯。此試劑只要在配製 acrylamide 溶液內加入 Phos-tag 即可，但此產品非常貴，每一次使用需要 1,773 元。

討論摘要：

 (1) 所用的 PPT 每個圖表都必須深入了解，並且有條理的向聽眾清楚說明。

 (2) 要注意書與打字寫格式，英文的拼字、發音與用法一定要正確。

 (3) 練習增加邏輯的能力及口說能力。

 (4) 如何判定所純化的 kinase 就是 PCS kinase？

 (5) 磷酸 (phosphate) 不要說成『磷酸根』，因為『根』是 residue 的意思。

 (6) 深入了解所有試劑的化學原理，以便順利執行實驗。

 時間表  

 4   錢 思 翰   利用細胞表面分泌抗體的能力分離細胞群  

 4   施 驊 珊   斑馬魚胚胎發育的相關標誌蛋白質  

 2   卓 越   主題  

 時間表  

 2   楊 己 任   找尋母源轉胚源過程的標誌蛋白質  

目前成果：

 2   邵 子 瑜   AtPCS1 在植物中的表現  

 1   謝 明 孝   禽流感病毒表面蛋白之表現  

目前成果：

 1   鄔 承 祐   CD133 (+) 細胞的癌化 markers  

 12   林 怡 岑   L-SP 與 20S proteasome 的交互作用與與功能  

實驗結果：

 1) L-SP 與 20S proteasome 之結合顯示 L-SP 可能經由一個不需 19S、ATP 與 ubiquitin 之 20S proteasome 路徑降解 L78，而且此降解作用會因 45C 熱處理而加速進行，此降解性修飾可能改變 L-SP 的生理活性，由合成澱粉轉為磷解澱粉，產生 Glc-1-P，進而促進 NADPH 生成，來減少因熱逆境產生 ROS 所造成的細胞傷害；另外，此降解現象也在馬鈴薯塊莖中觀察到。

建議事項：

 1) 如何給予甘藷切片 MG132 處理？有無滲透到組織中？處理完有無沖洗？

Ans：甘藷塊根切片 (2 mm) 於 45C 熱處理前，先浸泡在 100 mM MG132 下室溫反應 2 h，整個實驗流程是參考 Fettke et al. (2010) New Phytologist 185: 663-675。

 2) Satoh et al. (2008) 與 Hwang et al. (2010) 是用稻米的哪一部份抽取 L-SP，有無分胚乳或胚芽？

Ans：他們所使用的分別是用胚乳 (去除胚芽與種皮) 純化之 L-SP 以及 E. coli 表現之 L-SP。

 3) 我們所用的稻米之來源與品種？

Ans：由 518 實驗室所提供的台農 67 號，成熟曬乾的種子。

 4) 由演化樹是否能觀察出甘藷、馬鈴薯之 L-SP 與稻米中的 L-SP 有何不同？

Ans：它們分屬於雙子葉植物與單子葉植物。

 5) 可探討單子葉與雙子葉植物的醣類代謝差異，找出 L-SP 之降解性修飾為何在這兩種植物中會有差異。

 6) 一般給予熱逆境後的生理反應是什麼？ Zeeman et al. (2004) 他們是如何給予阿拉伯芥逆境的？

Ans：Heat shock proteins 表現量上升、水分含量下降、膜系不穩定、以及 ROS 生成。 Zeeman et al. (2004) 所給予的逆境是改變植物的生長濕度。

 7) 在開始寫 Discussion 前要多看 paper 比較，不錯過任何一篇重要 paper，寫完一個觀點就可以先給老師看。

 8) D-enzyme 有測定活性的方法嗎？可比較 monomer 與 complex 形式的活性差異。

Ans：可測定 Glc 之釋出。

 9) 可用抗體偵測 D-enzyme 和 L-SP 之間的 binding site，抗體抓不到的位置可能就是互相結合的位置。

10) 若要討論 SP-DPE complex 所組成之結構，必需重複瑩貞的實驗結果，使結果更清楚。

11) 若 SP-DPE complex 結構中 D-enzyme 位於內側，那代謝機制是否為先由 L-SP 作用，再將產物交給 D-enzyme？

12) FRET 結果要有 negative control，可用較成熟的甘藷塊根切片進行實驗。

13) 若要觀察 SP-DPE complex 所形成的高分子量色帶，光看 native-PAGE 可能不足以證明 (色帶太雜)？

Ans：會挑選幾個生長時期，進一步利用 gel-filtration 來觀察。

14) 需釐清 SP-DPE complex 之代謝作用機制，以及此 complex 形成的目的為何。

 時間表  

 14   何 杰 龍   HA1 上糖類部份對免疫抗原性的影響  

 1) 本實驗室 H6-HA1 單株抗體具特殊性質 - 當醣蛋白質 HA 上的醣類被去除，此抗體與 HA1 結合的能力會減弱，甚至消失。這是整個研究架構的開端，據此與後續實驗提出『HA 結構保護機制』的假說。但 D Day 有老師建議必須釐清 deglycosylation 的過程是否會因 PNGase F 含某種蛋白脢而產生誤判？為此補 control：以 HA1 表現蛋白質進行deglycosylation，結果證實，我們所看到的現象的確由外加的 trypsin 所造成，並非 PNGase F 所含某種蛋白脢而產生的誤判。

 2) 本單株抗體對 H6 亞型禽流感病毒 HA1 具有很強專一性，不過一直沒有量化。我們以 ELISA 進行抗體與抗原間親和力的評估，初步得到 K 值為 1.5 x 10^-2 mmole/L。並以此實驗選定 312.5 ng/mL 的抗體濃度進行 epitope mapping。

 3) 取 HA1 上可能為此抗體 epitope 的區域，設計部分重疊的 10 個片段進行 peptides 合成，以 bELISA 進行 epitope mapping。以 2838V 純化病毒 (V) 與表現蛋白質 (H6-HA1) 為 positive control，訊號皆明顯下降。可惜的是此批設計的片段 bELISA 結果都無明顯差異，已經設計第二批 peptides，目前正由廠商合成中。

 4) 實驗與資料整理與撰寫論文的速度要加快，請列出論文發表流程的時間表。

 時間表  

 3   林歆佑    PCS 在植物中的表現  

 1) 重新測量 over-expression T3 轉殖株的 mRNA、protein 表現量和 phenotype 性狀的比較。

 2) 測量 over-expression T3 轉殖株的活性。

 3) 要放上次 Master Day 老師們所提的問題並檢討，以及前一次進度報告的摘要， 並且看學位論文後面的答問錄。

 4) 要做 CIP 處理不同時間來比較 2D 圖譜的差異。

 5) 要做實驗計畫把時間和目標訂出來。

 時間表  

 3   錢 思 翰   差異性抗體庫的一些問題  

 3   施 驊 珊   搜尋胚胎發育期間的蛋白質 markers  

 1) 如何知道在小鼠的 oocyte 中不需要 glucose phosphate isomerase ?

在 2002 年 Kelly等人研究發現 glucose phosphate isomerase 基因被 knockdown 後，依舊可以生長到，代表此時胚胎的代謝來源並非 glucose。

 2) ALDH 與 MMSDH 對 branch-chain amino acid 結構是否有專一性 ? 此外，須了解 ALDH 與 MMSDH 在其中的機制。

 3) 若要製備抗體，是否製作豬的蛋白質，可利用在比對高產低產差異。

 4) 目前先以半定量實驗為主，確認 mRNA 表現量是否跟 protein 結果一致。

 時間表  

 1    卓 越   L-SP 的選殖與表現  

 1) SP 序列中的 L78 位於 cDNA 上 1,239~1,320 鹼基對的位置，即整段 L78 皆位於 SPi 的 3’ 端。

 2) 經過測試 PCR 程式的各個溫度之後，決定選用 57ºC 在 cDNA/primer 為 2/0.5 的條件進行 PCR，以取得較高純度，但較低濃度的 SPi 作為下一 PCR 循環的模板股。 (因為使用 57ºC 時較 56ºC 有較單純卻較淡的條帶)

 3) 未來將以含有限制酶切位的引子進行第二階段的 PCR，再放大 SP 序列的量之後，進行 TA cloning。

 4) 除了改變 cDNA/primer比例及溫度外，嘗試不同的 PCR 程式，例如提供兩個引子沾黏循環，以加強引子的附著。

 5) 設計不同的選殖策略，例如將不好選殖的 L78 從中間分成前後兩段選殖。

 時間表  

 1   楊 己 任   尋找母豬胚胎 MZT 轉換的生物標誌  

 1) 要找一個合適可信的  internal control (i.e. tubulin) 及定量方法。

 2) 整體口頭報告，切入主題時不太連貫。引用文獻，需寫出期刊名。

 3) 找出 β2m 的序列重做抗體。

 4) 可用免疫沈澱找與 β2m interaction 的蛋白質。

 5) 針對 β2m 的生物資訊學探索 (data mining) 加上 paper research 搜索 β2m 所知的相關生理功能。

 時間表  

 1   邵 子 瑜   植物螯合素合成酶 PCS 之 T49 突變株磷酸化分析  

 5   謝 瑩 貞   L-SP 與 D-enzyme 交互作用與可能的生理功能

 1) G1P 一定要以 Glc-1-P 表示，口述時 G2, G3, G4, G5 應以 maltose, maltotriose, maltotetraose 以及 maltopentaose 說明，避免聽者混淆。

 2) 未涉及 K_m、K_cat，不能說是酵素動力學。

 3) 設計實驗的目的及過程都需在報告時說明清楚。

 4) 分析形成 HX 對 D-enzyme 或 L-SP 有何幫助。

 5) 試著由結果推測出酵素作用的途徑，並進一步驗證反應過程中，是否有預期的中間產物生成。若欲證實 D-enzyme 可將兩個 maltotriose 轉變成 maltopentaose 給 L-SP 當受質，則可觀察反應過程中是否有 maltopentaose 產生。

 6) 實驗都是設計分解的方向，應將實驗結果與推測的路徑作連結，說明 L-SP 如何參與澱粉合成。

 7) 提升實驗結果的真實性有三個方法：

a) 重複實驗，至少三次以上。

b) 做好控制組，因為控制組也可以說好故事。

c) 以其他證據支持實驗結果。

 8) 找其他可以支持 HX 中 D-enzyme 及 L-SP 之次單元體比例為 1:1 的證據。

 9) 整理實驗結果的工作固然重要，但最後必須將實驗結果分類，並強調實驗的重點。分析實驗結果後，應先整理出各小節的結論，最後再依照邏輯連結成完整結論。

 時間表  

 5   黃 迺 茵   在阿拉伯芥過度表現 PCS 對植物鎘耐受性的影響

 1) 過度表現 PCS 轉殖株的 T2 子代已經過抗生素篩選，接著將以 IPCR 確定其基因插入位，再進行 PCR 確定此 T2 為 homozygote ，才能收取其 T3 子代，進行接下來的 PCS 性狀分析。

 2) 每次實驗都要做好控制組，這次的酵素動力學未做 wt 當控制組，之後做三重複時將補做。此外，在 PCS 活性剛升起來的基質濃度應密集配點，才能看出是否為 sigmoidal 曲線。  

 3) 將 PCS 以 CIAP 去磷酸化後，其活性沒有明顯差異，但以 CK2 磷酸化後的活性確實有明顯提升。經 CIAP 處理的 PCS 活性之所以沒有明顯改變，可能是由於純化出來 PCS 重組蛋白本來就沒有磷酸化，或是已被水解掉。

 4) 在 cad1-3 過量表現 PCS 的轉殖株經各種濃度鎘處理，發現可稍微降低 cad1-3 的鎘敏感性狀，之後將進一步觀察鎘耐受性是否跟 PCS 表現量成正比。

 時間表  

 2   林 歆 祐   PCS 的活性區 T55 探討

 2   錢 思 翰   斑馬魚胚胎蛋白質的抽取

 2   施 驊 珊   斑馬魚胚胎發育期間的蛋白質體比較

 7   賈 儒 珍   PCS 的各種定點突變 (決定活性分析條件)

 1) 查清楚 E. coli 有無磷酸化系統。 (黃迺茵 follow-up：原核細胞中也有相當的磷酸化現象。)

 2) 藻類 PCS 在 T49 附近沒有磷酸化訊號，不能被磷酸化修飾，因此和阿拉伯芥 PCS 相比較，合成 PC 的能力很低。

 3) 活性分析結果看起來 50 mM 鎘和 100 mM 鎘處理的 PCS 活性差異不大，用 50 mM 即具有代表性。

 4) 活性分析的酵素用量改為 1 mg PCS 較為合理，所有的突變株都用新條件重做一次。

 5) 活性分析的條件 (比如酵素定量、鎘濃度和反應時間) 必需可信，才有討論實驗結果的意義。

 6) PCS-N 的活性分析條件和其 pI 值過於接近，要調整 pH，先測一次酵素反應的最適 pH 值。

 7) 做 kinetics 時，mutants 的反應條件要和 WT 完全一樣，不能有差異。

 8) 以 S-methylglutathion 為基質做 kinetics，試試看不能與鎘結合的基質與 PCS 的親和力。

 9) C-domain 除了已經做好的 mutation 之外，還需確定是否有其他可能與鎘結合的 Cys 位置。

10) 多重覆幾次 C-domain 的活性分析實驗，確定有再現性後再深入追踨有意義的 mutants。

11) 確定以 second binding site 和 C-domain 之作用機制為論文主題，進行深入的探討。同時也要釐清 PCS 是否在植物中有磷酸化的機制。

 時間表  

 11   林 怡 岑   SP-DPE 複合物的對 G3 與 G4 的活性上升

實驗結果：

 1) 實驗結果顯示 L-SP 與 D-enzyme 結合形成 protein complex，所形成的 SP-DPE complex 對 G3 的親和力增加兩倍，對 G4 的 V_max 也顯著增加兩倍以上。

建議事項：

 1) 綠藻中 PhoB 跟其他型 SP 有何不同？

Ans：綠藻內共有 PhoA、PhoB 和 PhoC 三種形式。PhoA 類似高等植物的 L-SP，PhoC 類似高等植物的 H-SP，PhoB 與 PhoA 同樣位於質體中，但 PhoA 對 malto-oligosaccharides 的親和力高，而 PhoB 則對 malto-oligosaccharides 的親和力低。

 2) L-SP PI activity 的第一個轉折點產物為何 (從 slow initiation phase 到 rapid elongation phase)？

Ans：由王維德 (2006) 與林之儀 (2009) 的實驗結果推得 L-SP PI activity 的第一個轉折點產物為 maltose。

 3) 類似 GST-pull down assay 重要實驗的條件必須仔細說明清楚，例如蛋白質 loading 的量、各實驗組的差異，以及 elute 下來的蛋白質量那麼少是否具有可信度。

 4) GST-pull down assay 的結果顯示，純化的 L-SP 無法與 GST-DPE 結合，但 crude extract 中的 L-SP 卻可與 GST-DPE 結合，這結果告訴我們什麼？

Ans：這代表 crude extract 中的 L-SP 可能有某種後修飾，所以能與 GST-DPE 結合，而純化後的 L-SP，其後修飾可能被破壞了，因而無法與 GST-DPE 結合。L78 有沒有可能扮演某種角色？

 5) Confocal 實驗中控制組是如何進行？ 為何組織位置並不相同？

Ans：控制組所有實驗條件都一樣，但一抗改為 pre-immune serum；組織位置不相同是由於當連續切片放大到 1000 倍後，很難找到完全相同的位置。

 6) SP-DPE complex 就是所謂的 HX，但為了與 proteasome 那部份做區隔，D-enzyme 這部份改用 SP-DPE complex。

 7) Kinetics 須多重複幾次，更換不同批次的純化酵素進行相同的實驗，假如結果還是確定 K_m 或 V_max 值不會改變的話，可略做調整，使雙倒數圖交於 X 軸或 Y 軸，但不可違背良心判斷。

 8) 如何將 SP-DPE complex 與純化的 SP 及 GST-DPE 定相同酵素量進行 kinetics？

Ans：目前採用的方法是利用 ECL Western blotting 將目標蛋白質微調到相同的酵素量。

 9) Kinetics 的酵素量一定要一樣。 利用 ECL western blotting 定量蛋白質是否可信？ 有沒有辦法只利用 SP-DPE complex 本身互相比較？查查看其他 paper 是如何以 complex 進行 kinetics 的？

Ans：Tetlow et al. (2008) Analysis of protein complexes in wheat amyloplasts reveals functional interactions among starch biosynthetic enzymes. Plant Physiol. Vol. 146:1878-1891 以 immunoblotting 定量不同來源 protein complex 進行實驗。

10) HPLC 中的 G4~G6 的 peak 都太小，應該尋找最適合的基質濃度 (10 倍 K_m) 與反應時間進行實驗，使 peak 更明顯；另外，若要觀察反應的初始產物，剛開始的時間點應該測密集一點。

11) Modeling of SP-DPE complex structure 是用什麼軟體預測的？ Protein 接觸面積似乎很小？ 瑩貞的 data 顯示 SP 和 DPE 的結合比例是多少？

Ans：這是用 Discovery Studio 之 Protein-Protein Docking 軟體預測，另外由瑩貞的 data 顯示 SP 和 DPE 的單元體結合率為 1：1，所以應該可以用 SP 和 DPE 的單元體進行初步預測。

12) 為何 SP-DPE complex 中，若 D-enzyme 將基質傳遞給 L-SP，則初始產物 [G5] ≒ [G4]；若 L-SP 將基質傳遞給 D-enzyme，則初始產物 [G4] ≒ [G6]？

13) 為何 SP-DPE complex 的基質傳遞一定是單一方向，而非 shuttle 式的可逆方向？

Ans：目前還未看到有 paper 提出 complex 中的 substrate tunnel 為可逆的，但不排除 shuttle 可逆式之可能。

14) SP-DPE complex kinetic 實驗的控制組，除了要有 mixture of L-SP and D-enzyme，還要有 L-SP only 以及 D-enzyme only。

15) Glucan trimming model 中所 trimming 後的短鏈糖大約有多長？

Ans：由 Mouille et al. (1996) Preamylopectin processing: A mandatory step for starch biosynthesis in plants. The Plant Cell 8: 1353-1366 結果推測 debranching enzyme 所 trimming 下來的短鏈糖大小約在 G4~G12 之間。

16) Starch synthase 最短所需的 primer 為多長？ 會不會真正植物生理並不需特別合成 primer，由 SP-DPE complex 所產生的短鏈糖 (G4 or G5)，就可用來當 primer。

Ans：Szydlowski et al. (2009) Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthases. The Plant Cell 21:2443-2457 之結果顯示 SS IV 所需的最短 primer 為 maltotriose (G3)。

17) 澱粉是如何充實的？ 需了解澱粉的構造與澱粉合成機制，以及一開始形成澱粉的起始點 (十字中心) 位於組織中的哪部份。

18) 由組織免疫螢光染色的結果顯示 L-SP 和 D-enzyme 好像分布於整個 starch granules 中，並沒有特別集中在某處。

19) 整個實驗架構必須說明一個完整的故事，所以目前的故事是如何？

Ans：目前推測 L-SP 和 D-enzyme 所形成的 SP-DPE complex，是先由 complex 中的 L-SP 磷解 G4~G12 (glucan trimming下的短鏈糖)，接著再將無法繼續磷解反應的 G4 交由 complex 中的 D-enzyme 進行延長，這樣能有效幫助 L-SP 磷解 MOS 產生 Glc-1-P，供澱粉合成或其他生理反應使用。

20) L78 的斷裂與否跟這整件事情是否有關，需進一步探討。

21) Szydlowski et al. (2009) Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthases. The Plant Cell 21:2443-2457 之結果顯示在 ss III-ss IV double mutant 中，L-SP 的活性提高了接近 10 倍，這代表什麼生理意義？

未來工作：

 1) BiFC 可同時利用 sweet potato roots 和 rice 兩種物種的 L-SP 與 D-enzyme 分別進行。

 2) 設計不同的 kinetics 實驗 (改變酵素、基質和時間)，觀察酵素的 v_o、K_m 與 K_cat，推導出代謝方向，由簡單的實驗可解決重要的問題。

 時間表  

 13   何 杰 龍   主題

 時間表

 2   沈 志 昱   尋找豬胚胎發育的 marker

 0   報 告 者   主題

 時間表