P01

第三章  蛋白質

許多胺基酸連接在一起組成了蛋白質，因此蛋白質的性質基本上可由胺基酸的性質來推衍；但是因為一個個的胺基酸連成了長鏈，蛋白質的構造因此不但比較複雜，而且衍生出胺基酸所無法想像的次元與功能。

我們以人為的分類，把蛋白質的構造分成四種層次︰由胺基酸序列的 一級構造 開始，先捲繞成幾種固定的 二級構造，若干二級構造再組合成完整的 三級構造，成為蛋白質的一個分子。三級構造已經是蛋白質的獨立單位，可以有其生理及活性；但有些蛋白質分子，再次聚合若干如此的單元分子成為多元體，進而形成 四級構造，有更複雜的調節功用。

蛋白質是很具象的東西，學習蛋白質應注意其立體構造與功能的關係，在視覺上是一種愉快的經驗；因此要主動攝取並了解正確的分子概念，而非只是背誦一些分子構造與性質而已。

明白了蛋白質的構造之後，以此分子構造為根本，再去探討其性質；最重要的一點就是蛋白質必須維持其正確的分子形狀，也就是其 構形 (conformation)。蛋白質若失去正確的構形，就失去其活性與功能，稱之為變性 (denaturation)。 蛋白質最重要的性質，即如何保持其構形，如何導致變性，又如何回復其原態與功能，稱為復性 (renaturation)。

我們上課所說明的各章節，與 課本 的構造差不多，但較為廣泛而深入，請同學們一定要把課本看過一次，並做過習題。蛋白質部份更注重正確觀念的引導，請每次都要準時來聽課，以免漏掉重要的觀念。又因為上課時間實在太少，最好請每堂上課前先行預習，以免上課速度太快而跟不上。

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P02

細胞內巨分子的特性

三大類 巨分子，包括核酸、蛋白質、多糖類，除了其組成單位不同之外，卻有相似的基本構造特性，即上面所列出各要點。

(1) 巨分子一定是由小分子單位，一個一個串連起來的，絕非一開始就合成如此巨大的分子，這似乎是自然界的定律與生成法則。同時請不要忘記，核酸上的序列，很可能是生命延續之唯一目的；而此核酸序列再經轉譯成蛋白質，就成為生物形體，而有多采多姿的生命世界。

(2) 但巨分子絕對不只是一長條分子而已，巨分子多會捲曲成一定的構造形狀；例如 DNA 可捲繞成為 double helix，蛋白質有複雜的四級構造，構形更是蛋白質所有特性的根本。

(3) 各種巨分子的長鏈，都有其方向性，也就是說有頭尾之別；這種方向性，與其生合成時的反應方向有關；在巨分子功能上，方向性也扮演很重要的角色，會影響各種生理反應。

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P03

一級構造︰蛋白質的骨架

蛋白質的基本骨架是由 N-C-C-N-C-C-N-C-C 這樣的重複序列所構成，也請注意如何去辨認出其兩邊端點、a 碳的位置、如何找出每個胺基酸單位、找出胜鍵的位置。每一個 a 碳上面，都連結有某一胺基酸基團，這些側鏈基團的大大小小、帶電正負、極性非極性等性質，造成蛋白質的構造形狀，也成就了蛋白質的種種生物活性行為。因此，了解二十種胺基酸的構造、性質，對瞭解蛋白質的功能是極為重要的。

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P04

一級構造︰如何定出一級序列

蛋白質的一級構造就是其胺基酸的序列，早期是一個一個直接把 N-端的胺基酸切下來，再看是何種胺基酸，F. Sanger 如此定出了胰島素的序列，也得到他的 第一個諾貝爾獎。

但若知道某蛋白質的 cDNA 序列，則依遺傳密碼可以翻成胺基酸序列，也是可以得到其一級序列。由於分子生物學的快速發展，使得要定出某蛋白質的 cDNA 序列非常方便，現今多以此方法定整條蛋白質的序列。

但每段 DNA 有兩股，每股可以推出三種序列，因為密碼是三個核苷酸為一組，因此總共有六種可能的序列。這六種序列中，僅有一條是真的胺基酸序列；其實這並不難辨認，因為不是蛋白質的基因序列，會有很多終止密碼，因此所翻譯出來的胺基酸序列，都斷斷續續的。

F. Sanger 又因發展出核酸定序方法，得到 第二個諾貝爾獎，他這一生似乎都與序列有關；近來他在由英國最大的科學贊助團體 Wellcome Trust 成立的 The Sanger Center 從事基因序列解碼研究。

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P05

一級構造︰序列是有意義的

不管是核苷酸或是胺基酸的序列，都像人類的文字一樣，可能是有意義的，只是人類可能看不懂這種生命的文字。如同考古學家一樣，若科學家能夠解出核酸或蛋白質序列中的含意，則可能解出此一分子功能。事實上，我們也漸漸能夠讀出某些分子序列的意義，就像我們開始認得一篇古石碑文字上某些字句一樣。

除了這些有意義的字句片段之外，蛋白質整體的構形與功能，則取決於整段序列所載的信息。有時候整體的形狀比起其個別的胺基酸序列來得重要，例如所有生物的血紅蛋白 (Hb) 分子上的胺基酸序列相似性不見得都很高，但其整體構形卻極近似，因為都要正確地抓住 heme，以便能夠吸附一分子的氧。

會造成這種奇特現象的原因，是因為血紅蛋白是非常古老的基因所轉譯出來的，其基因在很早以前就出現在地球上，以便生物攜帶外界所供應的氧分子進入體內；但經過數十億年的演化過程，突變造成血紅蛋白分子上的胺基酸一直改變，但無論胺基酸如何改變，其整體分子構形不能變化太大，否則將無法結合攜帶氧分子最重要的 heme 分子。因此，一些不重要位置的胺基酸，都已經改變了；但與其構形或與 heme 分子結合有關的關鍵性胺基酸位置，則完全不能改變，數十億年來都保持一樣，稱之為序列的保守性。

這種保守性強的胺基酸序列，都有相當重要的功能，科學家也漸漸辨認出若干這樣的序列，稱之為 signal sequence。1999 年諾貝爾生理醫學獎 Blobel 的工作與 signal peptide 有密切關係。

◆ Scientific American: A Cellular Zip Code (1999 諾貝爾生理獎 Gunther Blobel)

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P06

二級構造︰形成原因

蛋白質的胺基酸長鏈，並不是一條隨意飄動的長線，因為胜肽鍵的平面不能任意轉動，使得此一長鏈只能有固定的幾種摺疊法。因此一級構造的胺基酸鏈，就會捲曲成 a helix, b sheet 及 turn 等幾種固定的二級構造，其原因如上所述。

因為二級構造的摺疊如此規律性，因此可以預測那些胺基酸易形成何種二級構造 (Ramachandran Plot)；尤其當數個胺基酸連續在一起時，可以準確推測得 a helix 或 b sheet 的形成。

這兩種二級構造的形狀與構成，請仔細觀察清楚，尤其是 a helix，其構造上有許多特別的地方。因為這些二級構造的存在，使得蛋白質成為一個相當堅固的巨分子，同時也賦予蛋白質功能上的活性。

◆ Alpha Helix & Beta Sheet (四個代表性蛋白質的構造分析，需要 Chime)

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P07

a helix 的性質描述

Helix 的捲繞方式不只一種，其中最常見的一種，是每 3.6 個胺基酸捲繞成一圈的 a₁₃ helix，每圈高度有 0.54 nm (中圖)，其分子上的任何氫鍵，由 13 個原子所夾 (請數右圖上半的白色數字)。

(圖中的 a 螺旋構造是 I. Geis 的作品)

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P08

二級構造︰氫鍵

二級構造上最主要的構成力量，就是氫鍵，且其數目很多。

由於 a helix 螺旋摺疊的關係，一個胺基酸的 C=O (carbonyl) 會與下游第三個胺基酸上的 N-H 產生氫鍵 (C=O…H-N)。而其間的相對位置與方向是如此完美配合，因此可以得到最大力量的氫鍵鍵結；同時因為 a helix 上的每個 C=O 與 N-H 都會結成氫鍵，整個 a helix 就以相當多數量的氫鍵為架橋鍵，變成堅固的圓筒狀結構。

氫鍵的形成是因為氫原子的低陰電性，容易被附近的強陰電性原子 (如氮或氧) 奪去電子，露出正電荷，再被另一個帶強負電性的原子吸引，產生類似離子鍵的吸引力，不過其力量很弱。若此三個原子 (O...H-N) 在空間上排成一直線，則所產生的氫鍵最強；但若不排成一直線，則氫鍵會減弱。因此兩方原子的相對位置，就變得極為重要。

除了a helix 外，b sheet 的長條之間，也會產生很多氫鍵，把 b sheet 的許多長條鏈連結在一起，成為一片堅固的盾牌狀構造。

除了蛋白質的二級構造外，氫鍵亦無所不在。水分子中有很多氫鍵，喝水時的確喝了很多氫鍵；DNA 的兩股間，也是以氫鍵作為鍵結，更是生命遺傳的根本機制。

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P09

二級構造︰a helix 整理

a Helix 是由 Linus Pauling 所發現，也因為對化學鍵的整體研究得了 諾貝爾化學獎。

其主要的構造性質摘要如上表，請按圖索驥在一張 a helix 的圖上找出以上所有的特徵。大部分蛋白質上都有 a helix，尤其是肌紅蛋白或血紅蛋白上，幾乎都是由 a helix 所構成的。蛋白質中的螺旋狀二級構造不只有 a helix，也有其它形式者，但以 a helix 最常見。

a Helix 上的胺基酸排列方式，使得序列上相差三或四個胺基酸者，在立體的位置上，排列最相近。 因此，位於 1, 4, 7…的三個胺基酸，捲成 a helix 時，剛好落在螺旋圓筒的一面而形成一條線。這種排列對蛋白質的整體構造相當重要，因為可以垂直的方式，使兩個或數個 a helix 聚集在一起，使蛋白質構造更為堅固；甚或再圍成一個大管子，可供物質通過。

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P10

二級構造︰b sheet, turns

b Sheet 也是二級構造的一種，與 a helix 形狀完全不同，是一種彩帶狀的長條，許多長條可橫向以許多氫鍵連在一起，成為一大塊堅固的平面構造。這兩種基本構造，可以同時在蛋白質中發現，共同組成了堅固的巨大分子。

在連接這些 helix 或 sheet 時，蛋白質以固定的轉角方式來連接，也是以氫鍵來造型的，稱為 b turn 或 g turn。 造成 turn 的胺基酸以 Pro 最為常見，因為 Pro 的環狀結構，使得其附近蛋白質的脊骨產生大的轉彎，因此容易造成 turn。

另有兩種不規則形狀者，都沒有一定構形。其中 irregular 雖是不規則，卻是有固定的形狀；而 random 則不但不規則，而且還時時在改變形狀。通常在蛋白質的兩端，比較容易有 random 的片段出現。

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P11

三級構造的組成力量

由若干二級構造單位，可組成一個完整的蛋白質分子，即為三級構造。

一些二級構造的組合，經常會重複出現在不同的蛋白質中，例如有許多蛋白質都有 aaaa 的二級構造組成，a₈b₈ 捲成的桶狀構造也常看到；可稱為蛋白質二級構造的 motif。 演化似乎偏好這些 motif 的構造，可能有其功能上或構造上的優點。

若胺基酸比喻成文章中的單字，則二級構造的 a helix 及 b sheet 就好像句子，由數個句子組成一個段落，即為上述的 motif，若干段落可組成文章，即整個蛋白質分子。這樣的一個 motif 段落，若在蛋白質分子構造上成為一個區域，則可稱之為 功能區塊 domain。

這些含有數個二級構造的組合，是以何種力量連繫在一起的？ 通常還是以 氫鍵 為主要力量，但請注意這些氫鍵並不是在 a helix 內以脊骨上的 C=O 及 N-H 所鍵結成的那些氫鍵，而是胺基酸 側鏈基團之間 所造成的氫鍵。另外，空間上相接近的胺基酸基團若分別帶有正負電荷者，也可以 離子鍵 相結合。水溶性蛋白質的疏水性胺基酸多藏在其分子內部，以 疏水鍵 造成了一個核心，可以穩定整個蛋白質分子的構造。 Cysteine 是帶有 -SH 基團的胺基酸，當兩個 Cys 的 -SH 遇在一起時，會經氧化反應而形成 -S-S- 的 雙硫鍵，可以把蛋白質的兩段脊骨像架橋般接在一起。雙硫鍵越多的蛋白質，通常對熱較穩定，因為分子比較不易被扯開。

雙硫鍵有以上的架橋特性，形成相當堅固的連接，但也可以被還原反應打斷，但打斷後的 -SH 也可以再氧化回來，恢復雙硫鍵。因此，早期 Anfinsen 以含有很多對雙硫鍵的 ribonuclease (RNase) 進行這種可逆反應的實驗，發現 RNase 可以因而在原態與變性狀態下來回轉變。

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P12

三級構造︰RNase 的例子

Anfinsen 提出一個說法，認為蛋白質的最終立體構形，是決定於其一級構造上的胺基酸序列；也就是說，蛋白質依其胺基酸序列合成出來後，其三級立體構造就可自動形成。蛋白質都像 RNase 一樣，可自由地把雙硫鍵打斷變性後，再經氧化回復雙硫鍵而恢復原態構造。這種說法大家接受了數十年，Anfinsen 也因此得了諾貝爾獎。

Anfinsen 選用 RNase 當實驗材料是很幸運的，因為實際上只有少數幾個蛋白質能夠經得起反覆變性與復性而仍然活著，RNase 是其中佼佼者。現在我們知道，並非所有的蛋白質都可以把它扯開來，然後再讓它自動折疊回去。甚至有許多蛋白質，在剛合成出一小段胜肽時，都沒有辦法正確摺疊，要靠一種輔助的蛋白質來進行正確的摺疊。這一大群輔助蛋白質，統稱為 chaperone；某些熱休克蛋白質就有 chaperone 的功能。

Chaperone 是很大的蛋白質複合體，由二、三十個蛋白質聚集成一個像 桶子 的容器，合成出來的蛋白質，可送到桶子內矯正其構形，變成正確的原態蛋白質後，才釋放出來。 若如此也摺疊不好，就會被送到另一種桶子，在其中被水解掉，回收使用。這另一種桶子的構造或者外型都與 chaperone 非常像，也是由很多蛋白質組成的，但其功用是水解摺疊不良的蛋白質。在細胞內，蛋白質分子的生與死是在一線之間，一個分子若不變成好的分子，馬上會被支解掉。

三級構造第一個被解出來的蛋白質是肌紅蛋白，Kendrew 及 Perutz 因此得到 諾貝爾獎。他們使用肌紅蛋白的結晶，以 X 光繞射法推算出肌紅蛋白分子上面每個碳原子的立體座標，使人們能夠『看到』一個蛋白質的真正面貌。

◆ Goldberg AL et al (2001) The cellular chamber of doom. Scientific American 284(1): 56-61

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P13

蛋白質轉譯後有很多修飾方式

蛋白質在合成之後，經常還要加上許多東西，才能成為真正有活性的分子；以上列出這些可能的修飾方法或添加物質。其中磷酸化是很重要的蛋白質修飾方法，被廣泛發現存在於細胞中，尤其在信息傳導上，扮演極重要角色，將在酵素一章詳述之。

想想一個問題，為何蛋白質除了其本身的胺基酸序列之外，還要加上這些形形色色的附加物？ 其原因當然是要補強胺基酸上官能基團的不足。回顧胺基酸的各種官能基，除開那些非極性的不談，極性的分子中，也都不帶有較為強烈的反應基團。因此，為了達成某些任務，蛋白質在形成基本的球狀巨分子後，再加上一些較具強烈個性的分子，可以幫助各種生化反應的進行。

上面的例子，請一個個把它們說明清楚，因為所有的例子將都會在未來的課程中，一再出現。

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P14

三級構造： Domain 功能區塊

上面說過蛋白質分子中的一些二級構造會先聚集起來，成為一個功能區塊 (domain)。 在很多蛋白質發現有若干 domains，但有些蛋白質卻只含有一個 domain，例如 myoglobin 即是。 請注意一個蛋白質分子中的各個 domain 都還是在同一個蛋白質鏈，domain 與 domain 間還是以胜肽鍵連在一起，並沒有斷開。

不要把 domain 與次體 (subunit) 混淆︰ 例如每個 hemoglobin 單元體分子只含有一個 domain，但有四個單元體 (次體)，因此是四條獨立的蛋白質 (一條轉譯產物)，不是含有四個 domains。

Glyceraldehyde-3-P dehydrogenase (G-3-P) 的兩個 domains 各賦有不同的功能：其一與其基質 G-3-P 結合以進行催化作用，另一與輔脢 NADH 結合作為氫的暫存區。細胞中所有的 dehydrogenase 都有很類似的 NADH domain，因為它們要催化類似的去氫反應，可能都源自同一個原始基因。而這類酵素的活性區也夾在兩個 domains 之間，提供一個相當好的催化口袋，以便有效地進行去氫反應；這可能也是 domain 存在的原因之一。

抗體 是相當奇特的分子，一個抗體分子含有兩條長鏈及兩條短鏈分子，而每一長鏈都是單獨由其 mRNA 轉譯出來的，但四鏈之間以雙硫鍵連接起來；每個長鏈分子含有四到六個球形 domains，每短鏈分子則含有兩個球形 domains，這些 domains 都是源自同一個原始基因。 Domain 在早期可能是獨立的基因，演化過程中一再地被重複拷貝使用，並可以不同的組合形式出現。

其實這不難想像，若分子演化果真是事實的話，則地球上所有的基因，都將溯源到恆古的一條或少數幾條巨分子，以後所有的巨分子都是由這些『基因夏娃』所衍生出來的，因此互相盜用或相類似也不足為奇。

◆ Stryer Biochemistry (5th ed) Fig. 16.7 (分子構造試用版，需要 Chime 及 Netscape)

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P15

血中氧分子的運送

四級構造 的妙用，可以 血紅蛋白 (Hb) 與 肌紅蛋白 (Mb) 的例子說明。

Hb 是四元體，有所謂的四級構造；Mb 為單元體，只有三級構造。Hb 在血中循環，由肺泡中取得氧分子，運送到肌肉中，下載給 Mb。 因此 Hb 必須得知，何時該吸收氧分子，何時該放出；也就是說 Hb 必須有感應氧分子濃度的能力，同時還得做出吸收或放出的動作。這些能力都源自其四級構造的組成。

在靜脈中 Hb 大多不載有氧分子，這時候它的四個次體分子都處於一種休息狀態，結合區不容易張開讓 heme 接受氧分子。 當 Hb 循環到肺部時，環境的氧分子濃度提高了，四個次體的任何一個分子接上一個氧分子後，馬上會牽動其它次體，使得其它次體的分子構造舒張，變得很容易接受氧分子。因此在肺部的 Hb 都很容易地滿載氧分子，經動脈輸送至肌肉。若當時肌肉相當勞累，需要大量氧分子的補充，其酸鹼度會降得比較低，Hb 就更容易釋出氧分子，而 Mb 則一昧地吸收 Hb 所下的氧分子，並無調節作用。放下氧分子的 Hb 就回復休息狀態，循著靜脈流回肺部。

蛋白質的構形事實上都不是固定不動，其分子會有某些程度的運動，上述的 Hb 分子也是如此。當其處於休息狀態時，是分子較為緊密的一種構形，稱之為 tense (T) 型；反之，若其構造較為疏鬆，則基質或其結合對象比較容易進入，稱之為 relaxed (R) 型。 T 與 R 型的變化，在酵素分子的活性調節也很重要。

◆ 下載本圖的動畫檔案 Hb.pps (MS PowerPoint)

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P16

蛋白質四級構造的意義

蛋白質的四級構造區分，應不只是構造上的一種組織單位，而有其在生理功能上的重大意義。

光看一級構造時，其序列只是一條胺基酸的連續排列，沒有人能說它是有生命的。 當此胺基酸序列漸漸捲成二級構造，生成 a helix 及 b sheet 等固定結構，再集合成三級的獨立單位，蛋白質因為有了固定的構形，產生了催化活性或生理功能。而當數個如此的三級構造進一步組成四級構造，分子似乎會有辨認的能力，知道何時該有較大的活性，何時該休息。具有活性的蛋白質巨分子，已經是生命細胞的基礎；而具有辨別力的四級構造，則似乎有所謂的智慧了。

回想一下宇宙的生成，起先是基本粒子的組成，接著是一連串的 組合，由小分子組成巨分子，到了巨分子的蛋白質，竟然還是以組合來達成某些特定的功能。這些大大小小的分子，組成了細胞膜、染色體、器官組織等，也組成了生命。

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P17

構形

構形 是蛋白質的一切。

若沒有正確的構形，蛋白質將喪失其活性，在細胞內也會很快被消滅。蛋白質的一切行為，都可以其構形來說明；而構形的形成，又根基於其一級構造的胺基酸序列；後者又是由基因上核 苷酸序列所轉譯而得的。

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P18

四級構造的作用

蛋白質為何要再聚成四級構造？ 原因不外 (1) 蛋白質或酵素活性的調節與 (2) 組成生物的構造。 Pyruvate dehydrogenase 是極為特殊的酵素複合體，包含三種酵素，剛好可以催化三個連續的反應，可使反應效率增加很多。

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P19

蛋白質的性質

蛋白質的諸般性質幾乎只是與其構形有關。

當蛋白質維持正確構形時，即為其原態分子，就可進行種種活動；當構形瓦解時即為變性，大多喪失活性。我們將探討如何維持蛋白質的正確構形，如何使蛋白質變性；同時將討論蛋白質的構形，事實上也非固定不動的，而是經常在活動著。

兩個蛋白質分子之間，可能會有特殊的專一性結合力，以便進行很多細胞生理反應，這也跟其分子間構形的互補有極大的關係；同時分子間的微弱吸引力 (二級鍵)，也是這種專一性的主要構成力量。

生物化學的方法當中，蛋白質純化是很重要且基本的技術，我的上課部份只列出講義，但沒有排時間在課堂講述；若有必要，請隨時參考網頁『酵素純化與分析』。

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P20

原態與變性

雖然有些蛋白質變性後可以在變性條件去除後，回復原態蛋白質，但並非所有蛋白質均可如此。 請如下表整理出組成蛋白質四級構造的鍵結力量，然後看那些因素可以破壞這些力量，就是使蛋白質變性的方法。

構成力量：

共價鍵

變性條件

一級構造

二級構造

三級構造

四級構造

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P21

SDS 破壞三級構造的疏水性核心

SDS (sodium dodecyl sulfate) 是一種界面活性劑，其分子上同時含有極性的硫酸根基團，以及非極性的十二碳飽和碳氫兩個部份。因此，其非極性部份可進入蛋白質的疏水性核心，與上面的疏水性胺基酸基團結合；同時其極性部份可以露出蛋白質外，與環境的水分子結合。如此一來，就會把蛋白質的內部翻出來，使蛋白質分子變性，成為一條沒有構形的長條分子，並且在分子表面均勻地塗佈上一層 SDS 的負電荷。

SDS 因此是一種強力的分子變性劑，蛋白質經 SDS 處理後，可以在膠體電泳中依據其分子量大小泳動，是極為有用的分析工具。

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P22

Mercaptoethanol 是抗氧化劑

b-Mercaptoethanol 的構造很像乙醇，但多了一個 -SH 基。此 -SH 基可以吸收氧分子，以防止氧化反應破壞蛋白質構形，可以說是犧牲了自己來拯救蛋白質。但它氧化後的物質，可能對蛋白質上的 -SH 基團產生修飾反應；若蛋白質的這個 -SH 基團對其活性很重要，則此蛋白質將反而被 mercaptoethanol 所害。

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