蛋白質體學與單株抗體應用

Proteomics and Monoclonal Antibody Tool

二次元電泳是研究蛋白質體的重要工具之一，可以方便解析細胞中的各種蛋白質，但所染出來的複雜蛋白質圖譜，通常都不太容易解讀。單株抗體是由人工製備所得到的專一性探針，可在複雜的二次元蛋白質圖譜，清楚地染出其所對抗的抗原蛋白質。這些能力使二次元電泳加上免疫轉印，成為分析蛋白質體極有用的利器。

前言

蛋白質體學的應用，是目前世界上熱門的概念與技術之一，這有其道理。因為掌握蛋白質體工具，等於多了一項超強的研究武器，可以看到傳統研究方法所無法觀察到的現象。這個工具對於生命科學之研究者而言，有如人類之發明輪子，或者發現電力一般重要。另外，蛋白質體學不只是一項工具的發明而已，也是整體研究觀念的改變，強迫科學家以整個細胞或生物的角度，去重新思考以往的研究問題；觀察角度不一樣，研究結果也會有很大的突破。

高產能 (high-throughput) 的概念，是在人類基因體計畫完成後，科學家開始要面對某一生物的全體基因開始的；因為每一個可表現的基因，都會產生其所對應的蛋白質，因此也由基因體學 (genomics) 衍生了蛋白質體學 (proteomics) 這個字，開始了蛋白質體學的應用。不論是基因體或蛋白質體，科學家必須處理數量龐大的基因或蛋白質，要以高產能的觀念來進行分離或檢定，有別於傳統的單一基因或蛋白質。而在處理數量龐大的蛋白質體時，如何快速而正確地檢定一個蛋白質的身分，是一個極關鍵的步驟。到目前為止，抗體仍是最方便而有效的方法，可以人工的製備流程，產生對目標蛋白質具有很高專一性的探針。

本章首先說明幾個主題觀念：(1) 蛋白質體學與二次元電泳、(2) 單株抗體的專一性及其應用、(3) 二次元電泳與免疫轉印的結合。然後提出一種想法，目的是把單株抗體的生產流程高產能化，並且配合蛋白質體學的發展與需要，嘗試製備整個蛋白質體中，大部分蛋白質的專一性抗體 (4)，以便應用在蛋白體的快速檢定，以及將來可能的抗體晶片製作 (5)。若你對製備抗體庫的問題不是很有興趣，可以跳過第 (4) 部份，直接閱讀抗體庫的可能應用。

(1) 蛋白質體學與二次元電泳：

要探索一個細胞的全體蛋白質，很難找到完美的方法，因為蛋白質的性質不若核酸均一，每種蛋白質都有其自身的特別個性；比較方便而快速的工具就是二次元電泳 (two-dimensional electrophoresis, 2DE)： 2DE 把所抽取出來的蛋白質，先後以等電焦集法 (IEF) 及 SDS-PAGE 進行分離，所有蛋白質在大約 20 cm 見方的膠片上分散開來，每一色點至少含有一種蛋白質，但同一種蛋白質可能會產生數個色點，這是因為蛋白質由基因轉錄後，還要經過各種修飾，因此會有許多變貌。 2DE 有許多先天上的缺點，最嚴重的是所看到的色點多寡，可能取決於抽取或分離方法的不同而有差異，一些微量或脂溶性的蛋白質不易抽出，因而很容易忽略掉關鍵蛋白質。雖然如此，2DE 還是較方便的折衷辦法，但在應用時要謹記其缺陷。

在收集了不同處理 (或突變株) 的生物樣本，分別以 2DE 比較其蛋白質體圖譜後，可以找出該變化所造成的蛋白質色點消長；這些有差異的色點可以直接挖出，並以蛋白質定序儀或質譜儀得知其部份胺基酸序列，配合已知蛋白質資料庫之搜尋與比對，就可得知該蛋白質色點的身分 (圖一)。

圖一蛋白質體工具的圖示流程，說明如何快速檢定出蛋白質的消長與身分。

若該種生物的基因體已經被解碼，則有另一個檢定方法，就是把這個未知蛋白質 X 挖出來之後，先經過專一性的蛋白脢水解成各種長短的胜肽片段，再由質譜儀 (MALDI-TOF) 得知這些片段的精確分子量；另一方面，在其基因體資料庫中搜尋，若某一蛋白質 Y 以同一蛋白脢進行模擬水解，可得到相同的胜肽片段，則可以推斷未知蛋白質 X 的可能身分就是 Y (圖二)。這樣所推得的結果相當可靠，但若你所研究生物的基因體還沒有解碼，就無法利用這個方法。

圖二未知蛋白質先以專一性蛋白脢水解成胜肽片段，再經 MALDI-TOF 質譜儀可得知這些片段的精確分子量，與資料庫模擬水解片段比較後可判定其身分。

鑑定得到一系列具有明顯變化的蛋白質，就可串連出可能的代謝或反應途徑，進而解釋在生理方面的變化原因。另外，細胞內的任何一個蛋白質，一定與一種以上的蛋白質或其他分子，有著交互的作用關係；這種蛋白質與蛋白質間的交互關係，環環相扣成一個巨大的網狀關係，並深刻地影響該蛋白質的功能，以及整個細胞生理作用的調節。

以上所述基因體與蛋白質體的發展，啟動了系統生物學 (systems biology) 的觀念，科學家對整體基因或蛋白質體的觀察，可用來探索以前所無法觸及的生理或生化問題。

(2) 單株抗體的專一性及其應用：

自然界有許多專一性的配對分子，例如：兩股 DNA 分子間的鹼基配對、酵素與其基質間的結合與催化、各種荷爾蒙與其受體、抗原與其抗體的結合等。其中，抗原與抗體的專一性配對，可用人為的設計與免疫操作，在實驗室中取得專一性的抗體；這是目前極少數可用人工產生專一性分子探針的方法之一。

抗體與抗原之間的高度專一性，一直吸引著研究學者的注意力；對於抗原抗體間的專一結合關係，免疫學家自百年前已從免疫沈澱法清楚觀察，後來又發展出雙向免疫擴散 (double diffusion)，以及酵素免疫分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，成為免疫化學的標準工具。這些免疫工具與方法，到現在都還應用在基礎研究，或產業界的各種檢驗及醫療用途上。

脊椎動物對外來的異物會產生抗體來清除之，這些外來異物稱為抗原，包括細菌或者各種巨大分子；尤其蛋白質是相當強的抗原，很容易誘生出專一性抗體。但一個抗體分子只與蛋白質分子上的一小段胺基酸鏈結合，大約在六到十來個胺基酸長度，這一小段蛋白稱抗原決定基 (antigenic determinant 或 epitope)。因此，一個分子量較大的蛋白質，可能有數個抗原決定基，可以誘生數種不同的抗體分子，稱為多價抗原 (multivalent antigen)。

而在生物體內，是由一種稱為 B 細胞的白血球負責抗體的合成；但是每一個 B 細胞只能產生一種抗體，對抗一種抗原決定基。若有一個多價抗原分子，可被宿主生物辨認出四個抗原決定基，則此宿主至少會產生四種 B 細胞，產生四種不同的抗體，分別對抗這四個抗原決定基 (圖三)。傳統免疫方法所得到的抗血清中，就是含有所有抗體的混合物，因此可以有效地與抗原結合，並且很快清除抗原，以維護生物體的健康。

圖三一個 B 細胞只能產生一種抗體，對抗一個特定的抗原決定基。通常蛋白質分子上都有很多抗原決定基 (多價抗原)，因此會誘生出許多 B 細胞，分別產生專一性的抗體。若把其中某一 B 細胞株單離出來，以細胞融合方法產生融合瘤，就可以在培養基中生長，並且產生均一的抗體，稱為單株抗體。

這種傳統抗血清雖然對抵抗疾病很有效用，但是有一個缺點：若是兩個不同的蛋白質有部份相同的胺基酸片段，並且都可以誘生抗體，則此抗血清會同時辨認這兩個蛋白質；由其中之一個蛋白質所誘生的抗血清，會與另外一個蛋白質有免疫反應，稱之為交叉反應 (cross-reactivity)。

若想像把抗血清中的每一種抗體都分離開來，以單一種抗體對抗原分子上的抗原決定基進行偵測，就可避開交叉反應的問題。同時，已知每一種 B 細胞都只能生產一種抗體，因此若能夠挑出所要的 B 細胞，大量培養後令其產生均質的抗體，就能達成上述目的。而這種抗體因為是由單一株 B 細胞所生產，也只含有一種抗體，稱之為單株抗體 (monoclonal antibody, mAb)。此關鍵技術是 1980 年代，由 Kohler 與 Milstein 兩位科學家在英國劍橋大學所研發，往後數十年無論在基礎研究或醫學應用上都有很大貢獻，也一起獲得諾貝爾獎 (1984 年)。

他們最重大的突破，就是發展出 B 細胞與骨髓癌細胞融合的方法。因為一般的 B 細胞無法在培養皿中活太久，因此不能如上述大量培養 B 細胞；而骨髓癌是一種淋巴癌細胞，與 B 細胞的背景相似，並且可以在培養皿中永久繼代下去，具有長生不死的特性。若將這兩種細胞混合，並以化學試劑 PEG (polyethylene glycol) 誘導其相互融合，兩組染色體混合之後可能產生重組，當細胞分裂數次之後，染色體數目回復正常，將可能有子代細胞同時兼具分泌抗體及長生不死兩種特性，稱為融合瘤 (hybridoma)。

單株抗體與傳統抗血清在應用上，有些不一樣的地方：(1) 單株抗體是由已經建立的融合瘤細胞所生產，因此只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固定的試劑，不像靠動物生產的傳統抗血清，隨著動物個體不同會有變化；(2) 單株抗體因為只含有一種抗體，無法像傳統血清一樣，與抗原產生免疫沈澱，因此雙向免疫擴散也無法產生沈澱線；(3) 基於同樣的理由，加上單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處，因此整體的結合力量可能不如傳統抗血清；(4) 但是單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。

當許多蛋白質的基因解碼後，其胺基酸序列得以順利推知，並且預測其分子上的抗原決定基；近年來也因此流行一種方法，先選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，大約有十到二十個胺基酸的長度，再以人工方法合成出這條胜肽後，接到無關的巨分子蛋白質 carrier，然後免疫動物產生傳統的抗血清。這種抗血清因為只會對抗一段很短的蛋白質片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為單專一性抗體 (monospecific Ab)。

另外，當基因操作技術發達之後，發展出噬菌體表現 (phage display) 的方法，期以取代傳統的細胞融合方法，以便得到類似單株抗體的專一性探針。這是利用噬菌體的外殼蛋白基因為架構，插入抗體基因上與抗原結合區的部份 (variable regions 或 domains)，然後利用基因洗牌方式任意修改這段基因，建立一個噬菌體基因庫並由其中篩選，找出可以表現對抗原具有高專一性結合的噬菌體。這種方法相當吸引人，因為可用人為的方法達成在細胞內所進行的免疫確認反應，同時若篩得此一噬菌體，可馬上取出這段具有高專一性結合的基因，經修飾之後應用為人體的免疫治療試劑。

(3) 二次元電泳與免疫轉印的結合：

雖然蛋白質體『幾乎』可以讓研究者看到了全體蛋白質，但是其中最重要、也最困難的工作，就是如何去檢定每一個獨立蛋白質，乃目前蛋白質體研究的主要挑戰。每一個挑出來的蛋白質色點，可以用蛋白質定序儀去定序，或者用質譜儀去檢定蛋白質片段，再以電腦資料庫比對該色點的身分；這個程序是目前蛋白質體學的標準流程，雖然很麻煩，但也是不得已。

如上一段所言，單株抗體是目前少數可以用人工操作，製備得專一性探針的方法。假如，蛋白質體中的每一個蛋白質，都有其專一性的抗體，則利用蛋白質轉印與免疫染色技術，就可以很快得知目標色點的身分，可說是極為方便且快速。

圖四舉出一個明顯的例子，以二次元電泳觀察竹筍快速生長過程中，其蛋白質體的變化。雖然二次元電泳圖譜顯示，竹筍在出土前後的蛋白質體的確有相當大的變化 (圖四 B)，但這些色點的身分與確實的消長情形，實在難以清楚辨認。若以一個已知的蛋白質 starch phosphorylase 為探索目標，發現在竹筍快速生長過程中，其活性也跟著下降 (圖四 A)。若有此酵素的抗體，並對上述二次元電泳進行免疫染色，先把跑好的膠片轉印到尼龍紙上，再用抗體為探針去抓出其目標抗原，由圖四 C 發現未出土竹筍的確有 starch phosphorylase 存在，而成長後的竹筍則完全看不到，與圖四 A 的觀察完全符合。

圖四抗體把複雜的二次元電泳圖譜簡化，清楚顯現所要追蹤的目標蛋白質色點。 (A) 竹筍生長過程中，starch phosphorylase 活性顯著下降；(B) 用二次元電泳追蹤這個過程的蛋白質體變化，色點很多而複雜；(C) 若以 starch phosphorylase 的抗體進行專一性染色，則可以清楚分辨其消長情形。

因此，在進行蛋白質體學研究的同時，若能夠生產對抗全部或大部分蛋白質的抗體，則對於檢定目標蛋白質的消長，將有極為關鍵性的效果。然而專一性抗體的製作，到目前為止，是相當困難而麻煩的工作，尤其是單株抗體的製作流程更可能長達一年，且通常每次只能處理一個均質蛋白質，而純化均質蛋白質則可能是一件更艱鉅的事。

(4) 建立蛋白質體的抗體庫：

因應蛋白質體的發展與需要，漸漸形成了以高產能方式，生產抗體的想法，希望能夠以整個蛋白質體為對象，製備每一蛋白質色點的抗體，組成一個抗體庫 (antibody bank)。而這種蛋白質體抗體 (proteomic Ab) 的產生方式，剛好可以應用單株抗體的製備特點，儘可能挑出所有可生產抗體的細胞株，同時也不用去純化每一個蛋白質。

基本上是利用免疫學『一個 B 細胞只產生一種抗體』的基礎原理，把整個蛋白質體一次免疫，然後挑出所有可以對抗此蛋白質體中，任何一個抗原的 B 細胞，確認單株化建立穩定的細胞株後，可生產對應的專一性抗體。理論上，此一想法應該可行，但事實上可能有許多操作上的困難度。預計在學理上主要的問題可能有以下三端：

(1) 整個蛋白質體中的每個蛋白質，其含量多寡不一，若要同時免疫，勢必有些抗原免疫量較大；而那些含量少者，免疫量也較少。

(2) 整個蛋白質體中的每個蛋白質，其抗原性強弱不一，抗原性強的比較容易誘生抗體，反之則不易。對胺基酸序列同質性高的蛋白質，則可能根本無法誘生抗體。

(3) 目標蛋白質體中所含的各蛋白質成員，是否確實代表整個蛋白質體？或只是其中的一部份？

第三個問題是所有蛋白質體研究的共同問題，目前暫時不去考量，儘量跟隨學術界認可的條件進行。至於前面兩個問題，其實都與細胞免疫反應有關，倒是可以一起處理。這兩個問題的相同困擾，就是單單一次免疫以及接下來的細胞融合，可能無法拿到所有蛋白質的抗體；因為含量少或者抗原性差的蛋白質，預料無法順利誘生抗體。

為了解決此問題，設計了一個方案 (圖五)，把蛋白質依照抗原性的強弱分成三類，希望能夠經過三次連續的免疫與細胞融合流程，就能夠收到大部分蛋白質的專一性單株抗體 (期望達八成以上)。在得到第一階段抗體庫後，做成親和吸著劑，把原來的蛋白質體通過此吸著劑，收集未吸附的蛋白質後，以 2DE 及免疫染色法檢查其蛋白質圖譜，再進行第二次免疫及細胞融合流程，製備第二階段抗體庫；再如法吸附中等抗原性蛋白質後，進行第三次免疫及融合。預定如此應可製備得 80% 以上蛋白質的抗體，若尚有重要蛋白質沒有得到抗體，可在 2DE 上挖出色點，單一或混合幾個蛋白質，再進行一次免疫及融合。

圖五以蛋白質體製備全部抗體的流程，依抗原性的強弱可分成三個階段，得到第一階段抗體庫後，製成親和吸著劑去除對應抗原，未吸附部份再進行下一波融合。

至於另一個問題，就是蛋白質含量的多寡不同，預期上面的方案可以同時解決。也就是在第二或第三次融合時，樣本已經吸收掉較高抗原性蛋白質，便可提高整體抗原的量，以便呈現低含量的蛋白質。

篩選抗體的問題：

篩選生產專一性抗體的細胞株時，通常都使用 ELISA，先在 ELISA plate 上吸附抗原分子，再利用此抗原為釣餌。若融合細胞產生了專一性抗體，就會結合到 ELISA plate 上所吸附的抗原，然後再以二次抗體來檢測 (圖六)；二次抗體是可以辨認小白鼠抗體的抗體，通常都由另一種動物獲得 (例如山羊對抗小白鼠抗體的抗體)，二次抗體上面並連接有追蹤的酵素或螢光，以方便偵測。吸附在 ELISA plate 上的抗原要使用均質蛋白質，才能產生有效率的專一性辨認；但是因為我們免疫的抗原是整個蛋白質體，因此也要以整個混合的蛋白質進行吸附，如此將使得 ELISA 的篩選產生嚴重的缺陷，只能篩選到含量較大的抗原，一些含量較少者將不易被挑選出來，將會加劇上面所提出來的問題 (蛋白質含量少、抗原性弱)。

圖六以酵素免疫分析法 (ELISA) 來檢定細胞株是否生產有專一性的抗體。若樣本中含有專一性抗體，就會與固相擔體上的抗原結合，否則會被洗掉 (不相關抗體)；再用二次抗體去結合此專一性抗體，觀察所連結的酵素活性呈色即可偵測。

可能的解決方法之一，就是在第一次篩選時，就使用一次元蛋白質電泳轉印及免疫染色，而不用較簡便的 ELISA。這將使篩選工作變成極為繁重，也必須設計高產能的篩選方式或自動化流程。然而也有其好處，就是可以很快在一次元電泳圖譜上，大致辨認出抗體所結合的色帶位置，有助於篩選出較為多樣的抗體，不會只挑出一些對抗相同抗原的抗體。

若某一蛋白質體在 2DE 電泳片上有 1,000 個色點，因為一種蛋白質可能不只產生一個色點，預估可能有 300 種蛋白質，則至少產生 300 株抗體。但因為上述之抗原性強弱不同，或者含量多寡的關係，並非所有抗體都會一起誘生，預估三分之一的話，大約應可篩到 100 株抗體，但又因為同一蛋白質可能會選到數個不同的細胞株，因此全數可能高達 200 至 300 株細胞，全都要在 2DE 電泳片上驗明其專一性，這是更為繁重的工作。有一個可能的方便做法是重複使用 2DE 轉印紙，在以第一種抗體染色後，先畫下色點的位置，再繼續進行第二種抗體的染色，如此進行下去，應該有個使用極限。最好使用化學螢光呈色方法，避免對抗原蛋白質的破壞。

另外，為了降低整體工作量，有一個策略是省去『單株化 subcloning』步驟。單株化是在挑出所要的細胞株之後，再以『限數稀釋法 limiting dilution』把細胞分散，使得每一個培養槽只有一個細胞，則由此單一細胞繁殖出來的細胞，就只含有均一化的純系細胞；否則，可能夾雜著不同的細胞株，也就不是單株抗體了。為了可以減少單株化的必要性，在剛融合完成後的細胞，必須分布在更多的培養盤中，希望以後所挑出來的細胞儘可能都已經是單株的狀況。對於重要的抗體，或者懷疑並非單株，可以個別再進行單株化的步驟。

免疫反應先導實驗：

一個有用的先導實驗，可能成為抗體庫製備的必要程序。就是在以目標蛋白質體對小白鼠進行免疫時，先收集各時期的抗血清，分別對 2DE 圖譜進行免疫染色，觀察所能產生抗體的強度與種類。圖七說明此一過程，在免疫一個月後，各蛋白質漸漸開始產生抗體，並且隨著免疫期間的長短，會有不太相同的免疫反應。也許可以混合兩種不同免疫期間的小白鼠 B 細胞，同時進行細胞融合，以節省篩選工作與時間。另外，圖七顯示一次免疫流程無法得到所有色點的抗體，因此圖五的階段式免疫及融合流程確屬必要。

圖七以竹筍的整體蛋白質為抗原免疫小白鼠，在一個月後漸漸產生抗體；在不同的免疫期間，可能會有不同的抗體產生。

(5) 蛋白質體抗體庫的可能應用：

得到某一蛋白質體的抗體庫之後，將可試著應用在種種生理現象的探討，這也是最令人期待的時刻。以竹筍抗體庫為例，其中最具學術價值的，是將此抗體庫配合蛋白質體學的整體性檢定，觀察綠竹開花前後的變化情形，或可推出竹子開花的分子機制。由於竹子開花不定期，且一旦開花則整片竹林全部一起開花，開完花後就逐漸凋謝死亡，因此誘導竹子開花的機制，一直是科學界未解的謎團。

當然，使用竹筍的抗體庫可能不很適當，因為竹筍的生長與竹子開花，可能是經由完全不同的機制。但是，相信有很多的代謝途徑是共用的，可以觀察得某些消長情形。另一方面，我們也可以找出在竹子開花前後，含量具有顯著增加，但無法被本抗體庫所辨認的蛋白質 (扣除法)，再以胺基酸定序或質譜儀判定此一未知蛋白質，則可突顯出與開花相關的關鍵性蛋白質。這些研究方式都還是要配合著蛋白質體學的觀念與工具進行。

蛋白質體的抗體庫一旦建立，很快就可以應用到抗體晶片 (antibody chip) 的製造。把全數抗體一個一個點在固相玻片上，並確定抗體可與其抗原專一性地結合；待測的樣本中若含有抗原蛋白質，就會被吸附到晶片的對應抗體上，再以各種方法檢測這些抗體色點。最方便的方法，是能直接測到抗原與抗體的結合，而不須利用標誌或者呈色反應，例如台大醫工所林啟萬教授利用表面電漿子共振 (surface plasmon resonance, SPR) 就可直接感應到抗體是否已經與抗原分子結合。

另外，若樣本中的全體蛋白質可以用螢光分子標幟上去，且不影響其抗原性，則可用為上述抗體晶片的直接檢測。更可使用兩種不同顏色的螢光標幟物，分別標示兩個待比較的蛋白質體樣本，分別進入抗體晶片進行結合，再比較兩個晶片上螢光色點的差異，即可清楚辨認出蛋白質體的消長情形。

所有這些應用，都還籠罩著一個隱憂，就是所得到的抗體庫是否完整。但這是取決於生物細胞的基因表現程度、蛋白質體的抽取方式，以及 2DE 圖譜的顯像能力，是目前所無法避免的根本性弱點。雖然如此，我們只要得到大多數蛋白質的抗體，就已經足夠以現有的方法與技術，由蛋白質體中觀察到很多有趣的生命現象。

本文為台大醫學院生化與分生研究所主編『蛋白質體學』一書之部份章節

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單株抗體 monoclonal antibody

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Nature (2000): Functional Genomics. Vol. 405 (no. 6788) 819-865 Insight

Nature Genetics (2002): The Chipping Forecast II. Vol. 32: 461-552

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Trends Guide to Proteomics III (2002): Supplement to Trends in Biotechnology. Vol. 20 (no. 12)

Trends Guide to Proteomics (2001): Supplement to Trends in Biotechnology. Vol. 19 (no. 10)

Proteomics, A Trends Guide (2000): Trends in Biotechnology. August issue supplement

Antibodies in Proteomics I: generating antibodies (2003) Trends in Biotechnology. Vol. 21: 275~281

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建立日期： 2003 年 3 月 24 日；修改日期： 2007/04/06