生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

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上接 E6-25

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為何 GP 經過磷酸化，或者與效應物分子結合後，會改變其活性？ 主要原因是因為 GP 可因磷酸化等修飾而改變其分子構形。

GP 的分子構形有兩種形式，其一是較為鬆散的 R 型，有較大的活性；另一為較緊張的 T 型，活性較低。 當 GP 被磷酸化或與小分子結合，就會在這兩種構型之間轉換，因而改變其活性。 蛋白質是利用其胺基酸序列中 Ser, Thr 或 Tyr 上面的 -OH 基團進行磷酸化，經磷酸化後這些胺基酸基團變成帶有極強的負電性，會造成與同一分子上其他帶正電基團間的吸引，因此而牽動分子改變構形。後來又發現，His 上的 imidazole 基團也會被磷酸化。

蛋白質的磷酸化及去磷酸化是相當普遍的現象，但加上磷酸後的活性是上升或下降，則隨蛋白質或細胞不同而異。磷酸化可說是蛋白質補足其二十種基本胺基酸基團太弱的方法，使得蛋白質有較強的基團可以應用；但比這還高明的是，利用後來才修飾上去的磷酸化，也可以用酵素去除之，結果變成一種轉換自如的修飾方式，機動性地調節酵素活性，可稱為『磷酸化-去磷酸化循環』控制。

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血糖 太高或太低對人體都有不好的影響，因此體內有極為複雜的血糖調節系統，主角是合成肝糖的肝糖合成脢 (glycogen synthase, GS)，以及降解肝糖以生成葡萄糖的肝糖磷解脢 (glycogen phosphorylase, GP)。 此二酵素分別受到荷爾蒙胰島素 (insulin) 及胰增糖素 (glucagon) 的影響，人體便可利用控制荷爾蒙的濃度來調節血糖濃度。

這兩種荷爾蒙分子到達目標細胞時，細胞膜上有此荷爾蒙的接受體，當兩者接合之後信息便可傳入細胞內，引發酵素活性，進行所需要的糖類代謝。 這些信息是如何傳導給最終的酵素 GS 及 GP？ 這即是最近極為蓬勃的信息傳導，以及典型的酵素調控機制。 注意荷爾蒙在血中的濃度很低，但若傳到了目標細胞，這個信號就可以在細胞內放大，產生很強烈的反應。

以下就以肝糖磷解脢為主要對象及實例，說明酵素如何以磷酸化、信息傳導分子以及迴饋控制的方式，進行其活性的調節。肝糖磷解脢具有以上各種調控機制，很少有酵素如此密集地被調控著，因為肝糖磷解脢在糖類的利用實在是太重要。 以下我們先瞭解肝糖磷解脢的分子構造及生化性質。

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當人體 血中的葡萄糖濃度上升，在短短數分鐘內，至少有兩種酵素的血中濃度會產生劇烈改變。肝糖磷解脢濃度很快下降，而肝糖合成脢急劇上升，都在數分鐘內完成。由此一觀察，有兩件值得注意的推論或事實。

(1) 血液中的葡萄糖濃度是一種訊息 (signal)，可快速誘發某些反應。

(2) 上述的兩種酵素在數分鐘內消長，不太可能是由基因的開關來調控，較可能經由對蛋白質的直接修飾來進行活性控制。

事實上，肝糖磷解脢可以直接與葡萄糖結合，因而迅速失去活性 (E6-51)。這整件事情，協同前頁的荷爾蒙調控系統，誘發目標細胞的信息傳導反應，共同控制血糖濃度。

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上面 兩種多醣類都是人類重要的能量來源。人類攝取澱粉，分解後產生能量，並且把多餘的能量以肝糖的形式貯藏在肝臟。當血糖過低時，即誘發肝糖的降解，以便釋出葡萄糖以供能量所需。肝糖的降解，主要經由肝糖磷解脢的催化；但肝糖的合成則須另一種酵素肝糖合成脢。注意肝糖也可貯藏在其他部位，尤其是肌肉也是主要來源，因此動物的肝糖磷解脢可分為肝臟及肌肉兩型，兩者功能相似，但是活性受到不同的調節方式。

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肝糖磷解脢 (GP) 可以對肝糖進行磷解反應，由肝糖長鏈的端點開始，把葡萄糖一個個切下來，並且加上磷酸成為 Glc-1-P，後者可以進入糖解作用以產生能量。

平常 GP 是以較不活躍的 b 型存在著，要用其專用的激脢 (GP kinase) 進行磷酸化，才成為具有活性的 a 型。而此激脢要受到另一種激脢 (protein kinase A, PKA) 的磷酸化才會有活性，才能去磷酸化 GP；而 PKA 又要受到 cAMP 的活化後，才有活性。

cAMP 是一個重要的信息傳導分子，當荷爾蒙 glucagon 與目標細胞接合後，就在胞膜的接受體上誘發胞膜內側的 G protein，後者會活化 ATP cyclase 使得 ATP 產生 cAMP。因此這一條路徑就把外界荷爾蒙所傳來的信息，經由 cAMP 傳到 PKA，再傳到 GP kinase 後，即可活化 GP 開始執行細胞任務，把肝糖分解成單糖，以供細胞或人體所需。

上述磷酸化只是 GP 的一種調節方式而已，是屬於共價鍵式的可逆修飾，因為磷酸化後的 GP 也可以用磷酸脢 (phosphatase) 去除磷酸，以恢復其非活性型 b。另外，GP 活性也受到其代謝物的影響，例如當血糖中有太多的單糖或能量分子，顯示不需要再水解肝糖；此單糖或能量分子 (如 Glc-6-P, ATP) 可以直接與 GP 結合，以迅速降低其活性。

因此，GP 除了磷酸化之外，其活性還可以受到 AMP, Glc-6-P 等小分子所調節；這些小分子都是結合在其活性區以外的地方，是有異於活性區的位置，因此特稱之為異位脢 。

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肝糖磷解脢 的研究相當成熟，可說是瞭解非常透徹的分子，其蛋白質分子構造已解出，是一個同質二元體，上面並有活性區、基質結合區或各種異位調節區。請注意磷酸化的位置在 Ser14，離 N-端很近；磷酸化之後，GP 轉變成活性型，開始磷解反應。另外在磷酸化位置附近，也有一個異位調節區，與效應物 AMP 結合，可在未磷酸化的情況下活化肝糖磷解脢。 同時，肝糖磷解脢的基質是分子量很大的肝糖，因此要先與巨大的肝糖結合後，再以活性區與肝糖分子的末端結合，催化其磷解反應。

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磷酸化 為何可以使 GP 變成活性型？ 當然是因為磷酸的強大負電荷所致，這個磷酸會吸引附近 Arg69 號上的正電荷，引起分子構型改變，使得活性區鬆開成為 relaxed form (R) 的活性酵素。而此磷酸也會吸引另一個次體的 Arg43，達成相同的活化作用。 這又是一則因構形改變，因而影響蛋白質功能的例子。

但是，磷酸化是以牽動分子構形來影響蛋白質的性質，有時候在改變構形之後，蛋白質反而變成 tense form (T) 而失去活性；因此，磷酸化以後的蛋白質活性如何變化，每種蛋白質都不太一樣，要以個案去檢討。

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Cyclin dependent kinase (Cdk) 受到磷酸化強烈的調控，其分子上的變動尤其劇烈。

簡單來說 (左圖) Cdk 上面結合了一個 ATP，當蓋住活性區的片段被磷酸化之後，因為磷酸之間的強烈互斥，此一片段被推開並且鎖住 (下方兩圖)，因而露出活性區。

事實上，Cdk 的調控方式還要更複雜些 (上方右圖)： 需先與 cyclin 結合後才能加上 ATP 並進行磷酸化，然後把上述片段移開。 在此之前，另有一磷酸化位置 (inhibitory P)，這個位置被磷酸化後，使得 ATP 進不去，因而抑制了 Cdk 活性，要靠另一個磷酸脢切除後，才會有活性。

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除了 利用磷酸化來進行蛋白質的調控外 (左圖)，還有一種相當類似的方法，就是利用 GTP 的添加與水解 (右圖) 來達成類似機制。 GEF (guanine nucleotide exchange factor) 誘使 GDP 放出並加入GTP，使目標蛋白質活性改變；接著 GAP (GTPase-activating protein) 則催化 GTP 水解成 GDP，使蛋白質變回原來的狀況。 GEF 的效果類似激脢，GAP 的作用類似磷酸脢，互相有抗拮的作用。

中央下圖的模型是接有 GTP 的 Ras 蛋白質，若 GTP 被水解成 GDP，會導致左側螺旋構造的改變 (特稱為 switch helix)，這個改變最終造成 tRNA 的釋放 (圖中沒有顯示 tRNA)。

同樣的，在 GTP-GDP 結合的調節方式中，目標蛋白質接入 GTP 後，活性的上升或下降都有可能。

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蛋白質 激脢的種類很多，由其基因序列可畫出演化樹，並分成數個集團，集團內成員之間的同質性更高。上左圖的紅色三角形，指出各激脢胺基酸序列上可能的變化點，可插入 5 至 100 個胺基酸片段，是作為該激脢與其它蛋白質間的專一性辨認與結合之用。 基本的激脢長度約 250 個胺基酸，因為專一性辨認區的插入，使得激脢的長度差異甚大。

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蛋白質 激脢中的 protein kinase A (PKA) 可以對較廣泛的蛋白質進行磷酸化反應，其本身的活性又被 cAMP 所活化。在某些細胞中，PKA 會進入細胞核中，並且磷酸化促進基因轉錄的蛋白質 (如上面的 CRE-binding protein, CREB)，啟動某些基因。

PKA 共有四個次體，含有兩個催化次體 (C) 及兩個調節次體 (R)，R 接受 cAMP 後即釋放出具有活性的催化次體。

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因此 肝糖磷解脢的活性調控交織成一複雜的梯瀑結構 (如上圖)，細胞內由 cAMP 開始傳訊，最後到達肝糖磷解脢，達成肝糖分解利用的目標。 但是細胞外的信息是如何傳遞進來的？以荷爾蒙 glucagon 為例，當 glucagon 找到表面有適當 receptor 的細胞，並且與之結合，接著在細胞膜上發生一連串的反應： 首先 receptor 接受荷爾蒙後，誘發 G protein 的活化 (詳細機制在下一張圖)，G protein 接著活化 adenylate cyclase (結環脢)，後者可以把 ATP 結環成為 cAMP，再往下的故事你大概都知道了。

這裡有一個重點，就是上述細胞的 receptor。 Receptor 就好像一家店的招牌，有咖啡店招牌的就可以喝咖啡，有牛肉麵招牌的就吃麵。細胞也是一樣，有各種不同功能的細胞，而其表面的 receptor 可以告知荷爾蒙正確的信息。因此，兩者的接合也是非常專一性的，有點像鑰匙與門鎖一樣，什麼樣的鑰匙開其對應的門鎖，不能搞錯。有了這樣的機制，如 glucagon 這般的荷爾蒙，才能找到正確的對象，把信息傳到，並且引起正確的反應。

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細胞膜上 到底如何傳遞信息？ 其方式實在非常多，一般依照 receptor 種類，可整理出三大類主要模式：

(1) G-protein-linked Receptor: Receptor 與 G protein 連結後活化之，G protein 本身是 GTP 結合蛋白，與 GTP 結合後可以活化 adenylate cyclase，後者催化 ATP 成為 cAMP。

(2) Enzyme-linked Receptor: Receptor 連結著激脢 (如 tyrosine kinase)，後者自我磷酸化活化自己，也吸引來一些酵素 (如含有 SH2 domain 的磷酸脢) 並且活化之，然後繼續下游的催化路徑。

(3) Ion-channel-linked Receptor: 與細胞膜上的離子主動運輸有關。

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細胞 表面的接受體 receptor 非常重要，因為它標明該細胞內的活動為何，以接受正確的外來信息，做出正確的生理反應。以肝糖代謝的細胞為例，可以接受 glucagon 的細胞，就會引發細胞內一連串反應，產生 cAMP 活化 PKA，此 PKA 接著對幾種酵素進行磷酸化反應，磷酸化的結果使某些酵素活性上升 (如 GP kinase, protein phosphatase inhibitor)，但也使某些酵素活性下降 (如 glycogen synthase, protein phosphatase)。其最後結果，就是使得肝糖的合成降低，增加肝糖降解，以供身體利用葡萄糖產生能量。

上圖的 protein phosphatase 會去除磷酸化 (見上圖彎曲向上點線箭頭)，因而降低肝糖磷解脢的活性，並且增加肝糖合成脢活性，與 glucagon 所要的結果相反，因此在這個細胞中被抑制 (雖然也是被磷酸化，但磷酸化後活性降低)。反過來看，此一酵素的 inhibitor 則被活化，進一步控制了 protein phosphatase 的活性。

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信息傳導 的說明例，分別有兩個互相對抗的蛋白質家族，共同控制細胞的分裂。

當細胞接受到外界的信息，由細胞膜上的受體接受，然後以 Ras 為主的信息傳導路徑，把信號蛋白▲傳入細胞核。在細胞核裡，抑制者蛋白原本抓住 E2F 轉錄因子，不讓 E2F 啟動目標基因。當信號蛋白進入核內與抑制者結合，釋出 E2F 與目標基因之啟動子結合，就可啟動細胞分裂。

另一個 P53 家族，有比較保守而謹慎的控制策略，P53 會啟動另一基因，轉錄並轉譯出另一種蛋白質 (六角形的援軍蛋白)，進入細胞核與信號蛋白結合，放出抑制者，後者再回去抓住 E2F 轉錄因子，因此又把目標基因關掉，細胞分裂就被中止。

若 P53 發現無法控制該細胞的分裂，有可能惡化成癌細胞時，P53 也會啟動細胞凋亡，把自己的細胞摧毀掉，以免癌化。

這兩個家族好像一個是激進的細胞分裂派 (Ras)，另一個是保守的控制分裂派 (P53)，共同制衡維持細胞的正常發展。這兩個家族的蛋白質份子中，若有出現突變而導致失效者，生物個體就很容易得到癌症。

◆ 細胞如何因為信息錯誤而失控  (所有動作可參考影片，取自 DNA 時代 2：解破癌症祕密)  wmv, 9.5 min, 15 Mb

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cAMP 對 PKA 的調節屬非共價性，並不像磷酸化一樣產生共價修飾；而另一個非共價修飾的分子，就是 calmodulin。 Calmodulin 本身又受到鈣離子的控制，當它遇到鈣離後，會與四個鈣離子結合變成活性形，然後與目標蛋白質結合並活化之。

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Calmodulin 像扳手一樣，改變目標蛋白質的構形，以使之活化。

上面的蛋白質是 CaM-kinase II，是一種需要鈣離子與 calmodulin 來活化的激脢。其分子上有一個催化 domain 及一個抑制 doamin，右上圖顯示在不活化的情況下，抑制 domain 蓋住催化 domain。 當細胞內的鈣離子濃度升高，calmodulin 接受鈣離子活化，就可以與 CaM-kinase II 的抑制 domain 結合，把後者移開，露出催化 domain；催化 domain 本身會磷酸化抑制 domain (左下圖)，使得催化 domain 更具有全部活性。 Calmodulin 會離開這個活性酵素，但活性還可維持在一半以上，需要另一磷酸脢水解掉其磷酸，才會把活性完全關閉。

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信息傳導 有一定的傳導路線，那一個分子傳給那一個，都有其專一性； 例如 cyclase 專一性地催化 cAMP 大量產生。本圖把這種路徑分成幾個層次，最後到達 effector cAMP，cAMP 會在細胞內產生特定效應，以執行所負的生理功能，也稱為 second messenger。

雖然每一個細胞內的信息傳導，都有相當的專一性，但不同的細胞間，其傳導路線卻有很大的彈性，可以把上述各層次的傳導單位，做各種不同的組合。也就是說，每一層都有可能許多選擇，細胞可以選擇某一傳導物質，而且可以有不同的效應。 例如，同樣是 kinase 的磷酸化作用，但有些蛋白質被磷酸化後是提高活性，有些剛好相反，端視該細胞內有的是何種蛋白質傳導分子。

因此，在信息傳導的設計上，細胞不但考慮到其工作效率，利用酵素的放大作用來放大信息 (amplification)；也考慮到整個細胞的經濟效益，挑選預鑄好的各種傳導分子，以便彈性地組合成各種不同的傳導路線，以適應細胞的種種不同需要 (flexibility)。

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大家 都發現蛋白質的磷酸化，是一種廣泛存在的機制，外星人是否也把蛋白質磷酸化？連我自己的實驗室也發現，十多年來所研究的酵素 starch phosphorylase，也有磷酸化的現象，可能控制催化反應的方向。

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異位脢 的最典型例子，就是 aspartate transcarbamoylase (ATCase)。此酵素催化上圖的反應，所產生的生成物會繼續代謝，最後生成 CTP。 此 CTP 會回頭與 ATCase 結合，再迴饋抑制其活性 (因為 CTP 太多表示不用再繼續此一代謝路徑了)。因為 CTP 與 ATCase 結合在其 R 次體上，而非 C 次體上的活性區，因此是一種道地的異位脢。

CTP 之所以能抑制 ATCase 的活性，是因為當 CTP 結合到 R 次體後，會牽動 C 次體的構形，使得 ATCase 由原來活躍的 relaxed form 轉變成較不具活性的 tense form。

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ATCase 的立體構造顯示其兩種形式： 具有活性的 relaxed form (R) 以及不具活性的 tense form (T)；中間的調節次體在與 CTP 結合後，分子構形做了轉動，使得催化次體變成 T form。請注意上圖 ATCase 的活性區是夾在兩個催化次體 (C) 之間，由兩個次體一起共同組成，因此總共有六個活性區。

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結晶繞射 的結果顯示 ATCase 的真正面貌，但是上圖只畫出其催化次體，右圖是各次體與基質結合後，形成 relaxed from 的樣子，比較 tense form 有顯著差異。

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上圖 整理出影響 ATCase 活性的兩種代謝物 (CTP 及 ATP)，及其動力學結果。在動力學上 ATCase 顯現出一種不同於傳統 Michaelis-Menten 公式的 S 型曲線。

正效應物 ATP 會增加 ATCase 的活性，表示細胞中有相當充足的能量，可以供應合成 CTP 以進行核酸合成，而負效應物 CTP 會降低 ATCase 活性；也就是說，當下游產物 CTP 太多時，除非細胞中也大量堆積著上游的基質反應物，否則酵素沒有必要達到正常程度的活性。

要造成異位脢這種調節效果，具有多元體的構造是必要的。而主要的關鍵在於，當此多元體中的任何一個次體接到基質時，會稍微改變其分子構形，並且把此變動傳到其他次體，也誘使其他次體構形的變化，因而使整個酵素分子的活性改變。

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S 型 曲線有其特別意義︰ 在 S 曲線上的轉折點 (也就是整個線條的中點)，代表 ATCase 的活性在此點之上很快變成活性型，此點之下則保持在非活性型。有點像一個負責開關的關鍵濃度，當基質的濃度到達此點，酵素的活性迅速上升；反之若在此濃度之下，酵素的活性保持著較低的活性。因此，異位脢可以說是具有感受環境中基質濃度的能力，藉以調節其活性的大小。

正效應物 ATP 會增加 ATCase 的活性，其動力學的 S 型曲線則變回原來的傳統式 M-M 拋物線。而負效應物 CTP 會降低 ATCase 活性，雖仍保持原來的 S 型曲線，但會往高基質濃度位移，亦即需要更高的基質濃度來維持其正常活性。

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酵素 的構形不是固定的，會在活性型 (relax) 與非活性型 (tense) 之間變動 (上左圖)；當酵素與基質或其他分子結合時，會因構形的改變而影響本身或相鄰次體的構形，因而造成整體酵素活性的變化，稱為異位現象 allosteric effect。

異位現象因為細部機制的不同，可以有相當多的不同方式，我把其中部份例子以圖示整理如上。最上圖是當一個基質分子 [S] 與酵素結合後，影響另一個次體的酵素結合區，稱為 homotropic (因為是活性區影響活性區)。中圖的正效應物 [A] 結合在活性區之外的位置，可以直接改變該次體的構形，使得基質更容易結合 (+)，也可以間接影響另一個次體的構形；因為是 [A] 效應物結合區影響到不相似的基質結合區，故稱為 heterotropic。而這兩個次體的構形若是同時改變，則成為 concerted (協同式)；若是先改變一個，接著再改變另一個，則稱為 sequential (順序式)。最下圖的負效應物 [I] 則在活性區以外的位置結合後，反而使基質不容易與酵素結合 (-)，並且也影響到另一個次體的結合。[A] 與 [I] 都結合在活性區以外的位置，稱之為 allosteric site。

請注意在各種情況下，動力學曲線的改變情形。正效應物 [A] 通常都會使各次體都轉變成 relax form，與沒有異位現象的酵素一樣，其 S 型曲線都會回復一般 M-M 公式的拋物線。 而負效應物 [I] 會降低酵素活性，雖仍保持原來的 S 型曲線，但往高基質濃度位移，亦即需要更高的基質濃度來維持其活性。

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肝糖磷解脢 的重要性可由其複雜的調控機制得證，幾乎囊括所有重要的調節方式。因此異位脢這種細膩的蛋白質調控方法，當然在肝糖磷解脢也有，而且效應物種類繁多。 (E6-30)

肝糖磷解脢的各種調控機制可以整理成為兩大類，其一為共價性修飾，就是 Ser 14 的磷酸化反應；另一則為非共價性的修飾，正向的活化物只有 AMP 一種，要特別注意並不是 cAMP；而負面的抑制劑則有許多，例如葡萄糖、Glc-6-P、ATP 與咖啡因。這兩大類效應物真是壁壘分明，例如 AMP 與 ATP 的能量狀況恰好相反，血中的 AMP 濃度高了，表示需要能量，因此活化了肝糖磷解脢以便進行磷解反應，取得能量；反之，若血中充滿了 ATP，則關掉肝糖磷解脢活性，不須再降解肝糖。注意肝臟與肌肉兩種 GP 的構造有點不一樣，只有肝臟 GP 才會受到葡萄糖的抑制，而只有肌肉中的才受 ATP, Glc-6-P 的抑制，都是為了調控活性。

上圖的右半部需加說明，在磷酸化之後，肝糖磷解脢很快由 T 轉換成 R，因此往下的箭頭較粗。但是即使有磷酸化，當加入負效應物時，也會由 R 轉回 T 而失去活性。

■ 注意兩邊的 R → T 變化 (請看兩條向上的虛線箭頭)，左右兩邊的非共價修飾物質不太一樣，左邊有四種而右邊只有兩種 (Glc, caffeine)，想一想為何會這樣？。

E6-52

AMP 對肝糖磷解脢的作用與 Ser14 的磷酸化其實很像，其作用位置也很接近，都是在靠近 N-端以及兩個次體鄰接的地方，如此可以方便同時影響兩個次體。 AMP 在肝糖磷解脢的插入處如上圖所示，與同一分子上的 Arg242 結合，也引來另一次體上 42 及 45 胺基酸位置的相互作用。

E6-53

血紅蛋白 的四元體與異位脢一樣有異位調節作用，能夠感受環境中氧分子的濃度，而做出改變分子構形 (R/T) 的反應；注意血紅蛋白也有 S 型反應曲線，與異位脢的行為完全一樣。

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