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Ten Commandments of Enzymology |
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酵素學十誡 |
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一位酵素學摩西的建言 |
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Kornberg 是酵素學與分子生物學的先驅，幾年前提出了『酵素學十誡』，描述有關酵素學研究的基本原則 (1~5) 與方法的建議與提醒 (6~10)。 |
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細胞現象 完全可用酵素催化機制來說明，這些機制以酵素為中心，組成一個龐大的代謝網路。酵素除了催化的主要角色外，還會受到其他因子的調節，並且與之進行交互作用式的對話，後者的研究還非常原始。而現代分子生物學，很多以 reverse genetics 的手法，以定點突變研究酵素的生理功能，也只是見樹不見林，談不上整個代謝路徑的重建，或者酵素蛋白質之間的對話。最近，生物資訊學以及系統生物學的發展，使得科學家以更大的角度與廣度來看，是一個好的方向，但要小心解讀所得到的觀察。 圖左：酵素學把複雜的細胞生理解析成酵素單位，然後個別研究此單位，釐清它的作用、專一性、調節機制等 (就是酵素動力學等)。分子生物學興起之後，只是進一步以基因層次來看酵素的作用，仍然有相當的侷限性。 圖右：由分析到整合。然後，把這些單位中，相關連的反應連結在一起，可以重建完整的生理現象，甚至整個代謝系統。最近基因體學、蛋白質體學，到代謝體、系統生物學等新興學門，其實說穿了，還是基於傳統酵素學單位，把這些單位組合起來，成為一個巨大的代謝體網路。 |
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令人驚訝地，不同生物之間的很多細胞零件，都可以通用；必須多利用微生物的知識，來發展高等生物的研究。很不幸，E. coli 對科學的貢獻非常大，但最近卻被認為不夠時髦，在美國申請計畫都不太容易通過。 以前大家不太相信低等生物的現象，在某些程度可應用到高等細胞中。漸漸地，很多基因體被解碼，更多的精密生物機制被釐清後，各種生物間的共通性，實在相似得驚人，也大大影響我對所謂高低等生物，這種具有『歧視』意味的名稱，有所警覺。 |
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不要 過分相信你可以順利解釋的事物；相反地，也不要被已知的事物所障，不敢相信無法解釋的東西 (catalytic RNA 的例子，Cech 投稿 Nature 時被三個酵素專家評審狠狠修理，最後還是被 Nature editor 救回來)。 『假設』是非常重要的能力，通常由靈感與機會提供一個成功的想法，然而不要被假設所拘絆，否則會失去很多大發現。 要小心檢查有沒有被假象欺騙，而 DNase 的例子是，事實被認為是假象。 五六十年前出版的老書『科學之路』 The Art of Scientific Investigation (W.I.B. Beveridge)，裡面有很多對科學哲學的建議與警句，到現在都還適用。 |
抑制性 的 ELISA 有點詭異，因為所得結果要反過來想：樣本中的待測物質濃度越高，最後呈現的顏色越低。這是因為樣本抑制了原先加在反應液中的抗體 (圖左)，使後者無法接到固相上，也因此酵素-二次抗體無法附著於固相，因而降低最後的酵素呈色。 |
若 待測樣本中含有一種常見的抑菌劑 NaN3，樣本濃度越高則 NaN3 也越多。剛好上述酵素-二次抗體中所用的酵素，經常是 peroxidase，會被 NaN3 抑制，因此呈現假象。 如何避免假象？ 只有一種辦法，就是多設計幾種 control 組，以幾種不同角度來檢定這個分析方法，是否真的可靠。以這個例子，你應該如何設計 control？ 設計 control 組是一種藝術，也是科學家功力高低的鑑別點。有些實驗中的控制組數目，甚至比測試組還要多很多，每個控制組都精密擊中一個可能的失誤點，或造成假象的可能原因。 如何設計好的控制組？應當把所有可能造成假象的因素先列出來，整理出幾個大類後 (把可能造成的相同原因集合為一類)，再分別設計針對該原因的控制組。通常是反應中缺少某一個因子 (或以無關的類似物取代)，或者增加某一個因子 (如專一性抑制劑)。 |
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觀察 一個科學事實，使用不純的酵素，通常是浪費時間。 但剛開始研究 DNA Polymerase I 時，是使用大腸菌粗抽液、ATP、牛 thymus DNA 以及放射性 thymidine 的混和反應液。後來釐清四種 dNTP 與六種酵素 (thymidine kinase, 四種 dNMP kinases, exonuclease III)，並認知反應液中的 DNA 有多重角色︰(i) 提供四種 dNTP的來源; (ii) 提供 template; (iii) 做為 primer ends; (iv) 所合成 DNA 產物的保護。其實是一個相當複雜的反應系統。 DNA polymerase 的問題是很複雜，因為它其實有兩種活性，可以說酵素分子本身，就『污染』了其他活性，這又要如何說呢？只能說，酵素或反應系統越是複雜，研究者就必須越有單純的信念，但雖由單純出發，並不排斥任何複雜的可能。 Urease 與 DNA polymerase 是簡單與複雜的兩個極端例子。 |
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剛開始時，找不出 DNA Pol I 是如何開始合成的，因為 DNA Pol I 無法在沒有引子的情況下合成 DNA；後來才發現，有一種特殊的 RNA polymerase (primase)，可以任何序列片段為模板，先合成一小段 RNA，做為 DNA Pol I 的引子。(又是一個 RNA world 證據) 很詭異地，Kornberg 雖然口口聲聲說，不要用不純的酵素或者不純的基質，然而他有關 DNA polymerase 的很多重要實驗，其實都要靠樣本中的一些不純物質，來達成整個催化作用。(Starch phosphorylase 也是一樣，要靠一點 protease 來造成降解。) |
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雖然 目前非常火熱，但不要太相信 genomics 與 bioinformatics 的分析結果，一定要回到酵素生化與生理功能的層次來證實。例如，若分析結果指向某個代謝路徑，那就要繼續應用傳統的生物化學方法，去檢驗這條代謝路徑上的相關酵素及代謝物，是否正如分析所預測般的消長？ (我自己的經驗，是經常得到意外的結果。) 晶片分析好像是偵查機，以大面積的掃描策略，看目標物可能在那裡，鎖定目標後，還要派步兵實地去檢查是否真的有標的物。(偵查機當然有可能看錯。) |
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細胞內 的分子間是非常擁擠的，因此一旦打破細胞，所有酵素分子都稀釋 20 倍以上，這必須考慮在內。另外，細胞內有胞器與胞膜，會影響酵素的催化活性與功能調節。也就是說，化學層次的觀察，可能與細胞內的真正活動，有一段距離；因此，最近的科學期刊相當重視有無細胞內證據，是否有真正的生理功能，而不只是試管內的實驗結果；這導致生物影像技術所獲致的結果，變成非常關鍵且必需。 |
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早期 的分子生物學，非常倚重病毒或微生物，不要忘掉這個簡單的系統。最近高等生物有許多模式系統出現，動物界的線蟲，與植物界的阿拉伯芥。 |
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放射性 物質的使用，目前也不再流行了，真是喪失一個重要的實驗工具；可能肇因於盲目相信放射線的可能傷害，以及無謂的環保概念。另一個原因，是被許多螢光標示物取代，然而這些標示物質的分子量都不小，可能會造成實驗上的誤判。放射線同位素，在化學上是完全相同的，實驗結果不會有任何爭議。 順便一提，抗體到現在還是非常好用，是科學家可以在短期間內，主動去求得的專一性探針。一有機會，就要想辦法去製備你所研究酵素的抗體。 |
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新的 代謝路徑，就有未知酵素來催化，也無法買到或由文獻查到。酵素像研究試劑一樣，有確定的成份與功效，是可以定義的恆定物質。 一開始時，尚不知 Poly P 的生理功能，因此無法以突變株來研究，只好硬著去找合成 poly P 的酵素，再由這個酵素的序列、在細胞中去除或加強，來判斷其真正生理功能。 |
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最後，Kornberg 誠懇提出要支持基礎研究，這才是所有科技發展的根本。例如，發現半導體三十年後，才知道如何應用，也才有今日的電腦產業。 我覺得要再加上『教育』。 |
未經 發表的研究成果，不算是完整的研究工作。我們理當努力發表我們的發現，但不必沈溺於 SCI 及 IF，應當堅持走自己的路。所有因為研究成果所帶來的榮耀，都只是副產品。 IF 只計算一篇論文發表後，接著來的兩年期間，所被引用的次數，以此來強調其衝擊性 impact，非常強調其新聞性，以及在當時的重要性。當然，ISI 也列有其他的計算方式，學術界也重視論文被引用的總次數，而非只是算 IF。總之，被其他論文引用，就算是一種『認可』吧；類似以『引用次數』來作為投票的選擇方式，以指標出重要的研究工作。但是，若有一個很重要的發現，無法被當時一般科學家所認知，那這篇論文的 IF 就會很接近零 (孟德爾那篇遺傳學定律就是如此命運)。 |
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建立日期： 2008 年 3 月 11 日；修改日期： 2009/03/14 |
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