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   酵素化學實驗

目      錄

Enzyme Biochemistry Laboratory

莊榮輝

吳建興 陳翰民 張世宗 林士民 劉育志

     標

    內

 

XYZ ABC

vi

 

新世紀的大事

viii

 

編排與使用方法

剖析本手冊的組織架構

x

   X Y Z

X

實 驗 單 元     Experimental Units

1

X0

實驗進行通則

所有實驗操作的共同守則

3

X1

粗抽與分劃

由甘藷塊根抽取出蛋白質

5

X2

膠體過濾法

依據分子量的純化方法

7

X3

離子交換法

分離效果極佳的色析法

9

X4

製備式電泳

以電泳製備近乎純質的蛋白質

11

X5

轉印及定序

轉印後的蛋白質可以定出序列

13

X6

酵素動力學

看酵素與基質的作用機制

15

Y

分 析 方 法     Analytical Methods

17

Y1

蛋白質定量法

列表指出如何由本手冊中找到 Y1-Y6  的實際操作方法

19

Y2

酵素活性分析法

Y3

原態電泳及活性染色

Y4

SDS 膠體電泳

Y5

轉印及免疫呈色法

Y6

酵素動力學測定

Z

基 本 操 作    Basic Techniques

21

Z1

自動吸管

所有研究人員的貼身輕型武器

24

Z2

天平及酸鹼度計

配製藥品試劑的最基本工具

25

Z3

離心機

分離操作時最常用的儀器

26

Z4

光度計及ELISA

測吸光度是最基本的分析方法

28

Z5

透析及濃縮

微孔薄膜技術的簡單應用

29

Z6

電腦及軟體

是最不可或缺的輔助工具

30

   A B C

A

    Basic Information

31

A1

實驗室規則

瞭解並且遵守實驗室的規定

33

A2

實驗之路

如何開始你的研究生涯?

35

A3

如何撰寫實驗報告

寫好實驗報告的方法

39

B

參 考 講 義    Background Materials

43

B1

生物化學基礎

酵素化學的生物化學基礎

45

B2

酵素純化與分析

實驗技術的背景及原理

103

B3

酵素操作方法

實地的操作技術流程

189

B4

相關研究計畫

國科會計畫之摘要與背景資料

223

C

參 考 附 件    Reference Attachments

229

C1

入門手冊

課程安排及分組

232

實驗室配置圖

234

儀器及各組組產表

236

每週值日工作表

237

如何開始?

238

C2

教師備忘錄

教學活動記要

240

教行事備忘

245

所有儀器試劑清單

246

C3

甘藷 L-SP 相關學位論文

已經有許多研究論文可供參考

250

C4

甘藷 L-SP 胺基酸序列

胺基酸序列是酵素分子的根本

251

C5

參考書目

參考其他相關的純化技術書籍

252

  Index

I

英中對照索引

253

 

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引 言 


其實這是個 Game

電腦科技的發達,使得電動玩具日新月異,其創新與多樣性實在令人眼花撩亂。在過關遊戲中,玩家要使盡各種方法,發揮自己最大的極限,去破解看似無解的謎題,或者打倒未知的妖魔鬼怪。科學研究有時跟電動玩具的過關流程很像,只是換了個場景,而你的勝敗則是關係著個人前途。

在設計一個酵素化學的實驗課時,發現一步一步的純化過程,與電動玩具的一關一關很像,而且經常是失敗後就進不了下一關。於是,我們就完成了這個由『六關』組成的酵素化學遊樂場,也邀請即將要進入酵素研究的玩家,進來一遊。因此,這個課程其實可以看成是一個 Game,過了這六關後,你就修成了酵素化學的實驗課。

既然是 Game,那就不能太簡單,也不能太單調無趣。因此,在實驗課進行的過程中,遊戲者不能太相信他所看到的,或他所做出來的結果;因為 Game 會騙他,可能以不同的變貌來誤導他走向迷途。他也要用所知的各種技巧,去對付肉眼看不到的對象–澱粉磷解脢,想辦法把它生擒過來,而且不能有其他雜物魚目混珠。


研究工作也是個 Game

無論你是做基因重組,或是傳統分類,研究工作其實也是個 Game。只是這個 Game 完成後,你可以拿到學位,有人可以將玩 Game 的心得與結果寫出來發表,更有國科會給你獎助金。因此,聽起來好像不賴,又有玩的又有拿,名利雙收。但最重要的是,你要對你的 Game 有興趣,要能與它耐心地周旋,或智慧地把真理誘出來。

據我所知,大多數玩電動玩具的人,都不是為了名利,多半只是好玩。很多人只是想揭開下一道門後面是什麼,有沒有更令人料想不到的發現。科學研究的極致,應當也是如此,純粹是為了解答那些未知的問題。為了這樣單純的一個目的,研究者可以千辛萬苦地做實驗,可以廢寢忘食地思考問題;外人看來極為無聊或無意義的事,其實是一種極為刺激及冒險的內在奮鬥與追求。


新世紀的蛋白質

分子生物學及基因操作風靡了過去五十年,兩者在基礎研究及應用科技上,都有其極度吸引人的地方,的確值得這半世紀的瘋狂與追逐。當人們漸漸認識基因之後,也深刻瞭解到基因終究是要以蛋白質的形式表現出來,而且基因的調節、複製與表現,也都要細胞內其它蛋白質的幫忙。這個色彩繽紛的生物世界,一大部分是由蛋白質所組成;生物體內在的基因雖然很重要,但其所表現出來的外在蛋白質,卻更為多采多姿。組成核酸的核甘酸只有 A, T, C, G 四種,而胺基酸卻有二十個,因此每一種蛋白質都有其獨特的分子構形,造就了蛋白質的生物活性與構造功能。

二十一世紀初期,人類將首度得知其自身細胞內所有基因的序列,可以貯藏在一片光碟之內。人類從來沒有如此偉大過,也從未感覺到如此渺小;人們能否因此而領悟到生命的意義,是個哲學問題。但 Central Dogma 清楚告訴我們,DNA 可以轉錄為 RNA,RNA 得以轉譯成蛋白質,因此我們將可以得知人類的總體蛋白質 proteome; 分析比對蛋白質的序列,可以推測大部分蛋白質的功能,我們得以拼湊出許多從未發現的代謝途徑。由這一片核酸光碟,也許得以建構一個虛擬細胞,且可能與實境不會相差太遠。


繽紛的蛋白質世界

核酸與蛋白質在分子上的微觀差異,居然也反映在巨觀的研究方法上。因為任一種 DNA 的構形都相差不多,只有其分子上的核甘酸序列不同;因此其純化、分析等方法都不會差太多。 反之,每一種蛋白質都有其獨特的分子構形、等電點、極性性質等,因此要用許多不同的方法去處理。若參觀過許多專門進行分子選殖實驗室,會發現所用的儀器或方法大致相同;但翻閱一本蛋白質純化與檢定的書,會驚於所用方法與儀器之多樣性與複雜性。

因此,當同學們埋首於純化或分析實驗時,請不要忘了酵素的蛋白質特性,以及深藏在蛋白質分子間的各種美妙性質。每一種操作或技巧,都有其根基於蛋白質基本性質的原理。當你忙於操作實驗時,可以停下來想一想,我在加的是什麼?加下去會有什麼反應?反應的原理是什麼? 甚至於把自己縮小進入試管,悠遊於微小的分子世界,想像一下澱粉是如何被合成的,蛋白質是如何進行催化作用。

一切都決定於你自己

     

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編排與使用方法 


整個課程就是 XYZ 加 ABC

我們常把基礎的事物稱為 ABC,因此本課程把相關的基本資料,編成了 ABC 三大部分。而實際要進行實驗操作的部分,也因其性質的不同,整理成為 XYZ 三大類。同學們可依循 XYZ 的設計或指示進行實驗,同時由 ABC 取得你所需要的背景知識或者操作範例。由目錄可以很清楚地看出這兩大範疇的內容。


以 ABC 建立背景基礎

A 的內容包含三項最基本的資料。 A1 規定你在實驗室中應當如何行為,以免造成困擾或危險。A2 假設你剛要進入研究工作,提供一些對新手的建議,包括如何確定研究方向、如何寫實驗記錄;並且再度提醒你是否真的對研究工作有興趣,否則應當早一點轉行,以免浪費你的時間、國家的金錢。A3 提出撰寫實驗報告的方法,若能遵循一些基本要點,應該可以寫出像樣的報告來。

B 部分收集了與酵素有關的基本講義及操作方法。 B1 是生物化學課程最前面的一部份,從大爆炸到細胞與分子,經由胺基酸及蛋白質,最後引出酵素的基本性質與機制,以便讓同學回顧最基礎的生物化學。 B2 則是對本課程所有的純化與分析技術,說明其基本原理與機制,因為實驗不應只是會操作自動吸管而已。 B3 是食譜般的操作手冊,把重要的操作方法,一步一步寫出來;同學可以選出適當的方法,做為你實驗操作的參考。 B4 是向國科會所提有關澱粉磷解脢的研究計畫,摘錄其中的摘要及背景知識,以便讓同學瞭解為何要進行澱粉磷解脢的研究。

C 則是其他可能需要的附件,以協助實驗的進行。 C1 是專供新同學很快進入情況的入門手冊,我們的講習課會從這一部份開始,循序把同學導入酵素化學實驗的世界。C2 是提供給教師或助教的備忘錄,把一些教學心得或經驗條列出來,並且附上本實驗課開班所需儀器物品的清單。 另外,本系有關澱粉磷解脢的學位論文目錄,或者澱粉磷解脢的胺基酸序列,都可能對本實驗的進行具有參考價值。 


以 XYZ 編織整個實驗

XYZ 的內容雖然都是實驗操作,但其性質卻大有差異。 X 是本課程所要進行六個實驗 (X1-X6) 的大動脈,是一週一步的純化過程。 但在每一週的純化操作後,都要進行各種分析工作,這些分析方法即編成 Y1-Y6。 因此,X 與 Y 有點類似 X 軸與 Y 軸,或者地球的經與緯,相互交織出整體的面來。 但是,在能流暢地進行純化與分析實驗之前,必須先學會正確地操作一些最基本的儀器或用具,我們整理出 Z1-Z6 六項基本操作,將在前兩天的講習中學習完成。

在所編列的各實驗單元中,我們使用了大量的流程圖。 其目的除了要讓同學們熟悉流程圖的作用之外,也希望同學能實地應用流程圖在自己的研究計畫;因為流程圖是一種清楚、方便而且具有邏輯層次的思考方式,可以讓你的計畫過程更具有條理,是經營研究工作很重要的工具。


要如何面對本課程?

全力投入』是完成本課程最基本的條件,若仍有塵事未了,最好暫時不要進入本課程;而且通常這類課程都不是必修。 至少在上課期間的六到八週,同學可能要付出相當多的時間與精力,以便達到本課程所規定的目標。 雖然有教師引導,也有助教在旁相助,但是本課程特別強調的是,學生必須自己完成所有的操作。

有此決心者,請準備三本記錄本;其一為實驗的記錄,內有方格者最好,其寫法請參見 A2 實驗之路所述;另一為講習課的筆記,記錄上課所引發的種種思考;最後為一本為解題專用筆記,用來回答 B2 講義所附的問題集。建立並且經營好自己的筆記系統,將是順利完成本課程,以及你未來的研究之路,所必要的一件大事。

一旦進入本課程,往後的六到八週間,將有一連串的課務待完成:

先參加一週基本講習,完成基本操作 Z,準備開始進入實驗流程 X1。

每週進行兩天實驗,其餘時間要整理結果,並且預習下週實驗。

每天上午九時準時上課,徹底瞭解實驗的基本原理,每週三要準備小考。

第二週起,每週三下午 2:00,準備參加並且報告 One-Page Show。

待 X6 結束一週後,進行總測驗。

總測驗後一週內,準時交出總報告。

     

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進度流程表 


 

 
 
 
       

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本網頁最近修訂日期: 2001/06/22