方法 P5

P5 蛋白質 N-端序列決定法 N-Terminal Determination

蛋白質 N-端定序的檢定採用 Edman degradation 方法，利用蛋白質自動定序儀進行胺基酸的序列分析；整個實驗系統避免使用具有胺基的物質。

儀器用具：

轉印用具及試劑如 P4，但轉印緩衝液須避免使用含有胺基的 Tris 及 glycine。

試劑藥品：

轉印緩衝液 (blotting buffer) 1×：

CAPS (Sigma C-2632)	(10 mM)	22.2	g

加水 600 mL 溶之，調整 pH 至 11 後，加甲醇 100 mL，再加水至 1,000 mL攪拌均勻；最後含 10%甲醇，可視需要調至 20%。
(CAPS = 2-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid)

操作步驟：

1) 轉印的方法與步驟如上所述，單一色帶的蛋白質含量最好有 0.1 mg 以上。

2) 取出轉印膜，以五分之一濃度的 Coomassie Brilliant Blue R-250 染液短暫染 1 min，或等到色帶剛出現之時，即以 50% 甲醇脫去背景顏色；若蛋白質濃度低，脫色時間需較久；若背景顏色太深，可用 100% 甲醇脫色。染色脫色後，將轉印膜放入二次水中清洗，再放入烘箱中乾燥。

3) 將轉印膜上的目標蛋白質色帶切下，以封口袋保存，送往儀器中心定序，目前所使用的儀器為 Applied Biosystems 的 Model 492。

4) 也可以把切下的轉印膜放入水解管中，加入 0.6 mL 水解液 (HCl : TFA = 4 : 1)，抽真空封口後在 140℃水解 3 h，水解液可進行胺基酸成分分析。

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2011/07/15