2-DE Protocol

 
     
 
         
     

P4 轉印及免疫染色法 Western Transfer & Immunostaining

 
         
     

P4A 蛋白質轉印法:

 
         
     

蛋白質電泳膠片經轉印於轉印膜表面後,可以進行免疫染色法、蛋白質 N-端序及酵素活性染色等。 轉印膜 PVDF (polyvinylidene difluoride) 是一種疏水性材質,蛋白質可藉由本身的疏水性部分與其結合。

 
     

 

 
     

儀器用具:

 
         
     

a) 電泳轉印槽 (Hoefer TE22)

 
     

b) 轉印紙 (Millipore Immobilon, PVDF)、濾紙 (Whatman 3 mm)

 
     

c) 電源供應器

 
         
     

試劑藥品:

 
         
     

轉印緩衝液 (blotting buffer) 1×:

 
     

CAPS (Sigma C-2632)

(10 mM)

22.2

g


加水 600 mL 溶之,調整 pH 至 11 後,加甲醇 100 mL,再加水至 1,000 mL攪拌均勻;最後含 10%甲醇,可視需要調至 20%。

(CAPS = 2-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid)

 
     

 

 
     

標準蛋白質組合:

 
   

 

預先染色之分子標準 (GeneTeks PreBlue Orange Protein Ladder):

 
     

    160, 110, 90, 70 (橘色), 55, 45, 35, 25, 15, 10 kD

 
         
     

操作步驟:

 
         
     

1) 將所要轉印之 SDS-PAGE 或 native-PAGE 膠片浸於轉印緩衝液 (1×) 中,平衡 20~30 min。通常 SDS-PAGE 中的蛋白質分子量較小,因此要加入 10% 的甲醇於轉印緩衝液中,以避免小分子蛋白質過度擴散或穿過轉印膜

 
         
     

2) 轉印膜 PVDF 切割成比膠片稍大,因膠片平衡後體積會略漲。 PVDF 為疏水性,必須先以 100% 甲醇短暫溼潤後,再浸入轉印緩衝液 (1×) 中備用

 
         
     

3) 取兩張稍大的濾紙,於轉印緩衝液中浸潤備用。取出轉印卡夾,先墊一張多孔性海綿,鋪上一張濾紙,再小心鋪上膠片,勿陷入任何氣泡,鋪上轉印膜,再蓋上一層濾紙及海綿,再把整個膠片卡夾裝好

 
         
     

4) 置入已裝有轉印緩衝液 (1×) 的轉印槽中,注意 PVDF 那面朝正極,膠片面朝負極。除去卡夾外面的氣泡,氣泡的存在將使轉印效率變差

 
         
     

5) 以 400 mA 進行轉印,於 4℃中轉印 60 min 後中止。取出轉印膜,浸在尿素洗液中洗 1 h 以上;尿素可洗去 SDS-PAGE 樣本蛋白質分子上的 SDS,同時可以將蛋白質分子部分恢復原態,以增加抗體確認機率

 
         
     

6) 在電泳過程中若有 pre-stained 的標準蛋白質,可作為轉印效率的參考

 
         
     
 
         
     

P4B 酵素免疫染色

 
         
     

電泳後把蛋白質轉印至 PVDF 轉印膜上,利用專一性抗體對膜上的蛋白質抗原做專一性結合,再用二次抗體對上述抗體進行專一性的結合;而因二次抗體上連結有呈色用的標誌酵素 (多用 horse radish peroxidase, HRP 或 alkaline phosphatase, AP),可呈色而得以偵測。 二次抗體上也可連結 biotin,再藉由 streptavidin 架橋與 biotinylated alkaline phosphatase 結合,一個 avidin 可與四個 biotin 結合;這種免疫染色步驟可達放射性顯像的靈敏度,且其專一性也可增強。

 
         
     

儀器用具:

 
         
     

a) 平台震盪器

 
     

b) 塑膠染色盤

 
     

c) Autochemi system (UVP)

 
         
     

試劑藥品:

 
         
     

明膠-NET:

 
     

Gelatin

0.25%

(Merck 4070)

2.5

g

NaCl

0.15 M

(Merck 6404)

8.75

g

EDTA·2Na          

5 mM

(Merck 8418)

1.8

g

Tween 20 

0.05%

(Merck 822184)

0.5

mL

Tris 50 mM

 

(Sigma T-1530)

6.05

g


加水 800 mL 並加熱至 gelatin 溶解,調 pH 至 8.0,再加水至 1,000 mL。

 
         
     

PBS (phosphate buffer saline) 5×:

 
     

NaCl

0.13 M×5

(Merck 6404)

38

g

NaH2PO4

0.101 M×5

 

7.8

g


加水 800 mL 溶解,用 NaOH 調成 pH 7.0,加水至 1,000 mL,成為5×PBS。

 
     

  

 
     

PBST (phosphate buffer saline & Tween):

 
   

 

PBS 5× 稀釋至 1× 並加入 0.05% (v/v) Tween 20,即成為 PBST。

 
         
     

Urea-PBST:

 
     

Urea

6 M

(Sigma U-1250)

36

g


加入 PBST 加熱溶解後,以 PBST 定量至 100 mL。

 
         
     

一次抗體:

 
     

通常要免疫大白兔或小白鼠自行製備一次抗體,一般抗體的使用濃度在 1:1,000 至 1:5,000 之間,視抗體效價而定,使用前以上述 明膠 -NET 稀釋之。 注意每組所分到的一次抗體可能不同,請小心查詢是那一種抗體。

 
         
     

二次抗體連結體:

 
     

通常都可以購得上述一次抗體的二次抗體,並且連結有標誌酵素或者標誌物 (如螢光物或者 biotin);使用濃度依照廠商建議,稀釋在 明膠-NET 中。

 
     

注意二次抗體的種類很多,差別在其純度有高低,以及所對抗的一次抗體種類不同 (如抗 IgG, IgM, IgA 或全部),或抗體的部位 (如抗整個抗體分子,或者只有 Fc 或 Fab 片段),同時連結物的種類也很多;請小心以免購買不適用的二次抗體。

 
         
     

A + B 試劑:

 
     

A Reagent

streptavidin

(Vectastain)

10

mL

B Reagent

biotinylated alkaline phosphatase

(Vectastain)

10

mL


加入 15 mL NET 稀釋 1,500 倍,混合均勻後,室溫下先放置 30 min 後使用。

 
         
     

HRP 呈色劑 DAB:

 
     

Diaminobenzidine

(DAB)

(Sigma D-5637) 

5

mg

H2O2

30%

(Merck)

10

mL


用 100 mL PBS 溶解,必須新鮮製備,不可放過夜;DAB 是致癌物質。

 
         
     

操作步驟

 
         
     

 1) 尿素洗過的轉印紙再以 PBST 洗三次,每次 10 min。

 
         
     

 2) 加入一次抗體 (適當濃度溶於明膠-NET 中),室溫下反應 1 h。

 
     

一般抗體的使用濃度是在 1:1,000 至 1:5,000 之間,視抗體效價而定。

 
         
     

 3) 以 PBST 洗 3 次,每次 10 min。

 
         
     

 4) 加入二次抗體 (biotinylated 2nd Ab),室溫下反應 1 h。二次抗體同樣也溶在明膠-NET 中,使用濃度請參考廠商說明書指定濃度。

 
         
     

 5) 以 PBST 洗 3 次,每次 10 min。

 
         
     

 6) 加入預先混合 30 min 之 A + B 試劑,反應 1 h。

 
         
     

 7) 再以 PBS 洗過 2 次後,倒入 HRP 呈色劑 DAB,褐色色帶開始出現。

 
         
     

 8) 呈色約在 10 min 內完成,應當在背景開始加深前中止呈色。

 
         
     

 9) 倒去呈色液,並以蒸餾水清洗數次,取出晾乾後避光保存。

 
         
     

10) 免疫染色結果的好壞,取決於每次清洗步驟是否完全且徹底;過於隨便的清洗步驟會造成染色結果不良。

 
         
     

若以化學冷光呈色,則在步驟6) 以後改用以下試劑及呈色方法:

 
     

冷光反應劑:

 
     

A Reagent

Stable peroxide solution

(Pierce)

1

mL

B Reagent

Luminol/Enhance solution

(Pierce)

1

mL

 
         
     

 6) 吸取冷光反應劑 A、B 各 1 mL 混和均勻後,加入轉印紙上,置於冷光螢光攝像及顯像系統 (UVP AutoChemi system) 中,於 1~3 min 後可以得到免疫染色結果。

 
     

 

 
     

7) 免疫染色結果的好壞,取決於每次清洗步驟是否完全且徹底;過於隨便的清洗步驟會造成染色結果不良。

 
     
 
         
     

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2011/07/15

 

[Figure 2]  Western

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