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P2 二維電泳分析 2-D Electrophoresis |
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儀器用具: |
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a) IPGphor, strip 及 holder (11 cm) |
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b) SDS 電泳槽 (Pharmacia Ruby) 及供電器 |
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c) 微波爐 |
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試劑藥品: |
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SDS 平衡 buffer: |
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2-DE SDS 膠體溶液: [Table 2] |
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Monomer stock solution (30%T, 2.6%C): |
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Resolving gel buffer (4X): |
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Agarose (0.5%): |
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操作步驟: |
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1) 取以 sample buffer 溶解好的樣品 200 mL (11 cm strip holder 只能容納 200 mL),先將樣品放入 holder 中,再輕輕放入 strip gel,確定 strip gel 下無任何氣泡,最後覆蓋上 0.8 mL cover oil,防止 strip 乾掉或 urea 結晶。 |
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2) 使用 IPGphor system,先以 30 V 電壓將 strip rehydration 12 h,使 strip gel 膨潤,再進行設定的 program 如下: [Table 3] |
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3) 待 IEF 進行結束後,將 strip 以二次水清洗,以去除 cover oil,若無法立即進行 SDS 電泳分析,先將其放入 -80℃保存。 |
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4) 若立即進行 SDS 分析,夾出 strip 放入 5 mL SDS 平衡緩衝液 (加入 50 mg DTT),平衡約 12~15 min 後,再放入 5 mL SDS 平衡緩衝液 (加有 125 mg iodoacetamide) 平衡約 12~15 min,接著進行 SDS 電泳分析。 |
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5) 將預先鑄好的 SDS 膠片從冰箱中取出,待其冷卻後再進行電泳檢測,先在膠體上層放入 SDS running buffer,使 strip 較好放入;strip 放入後檢查 strip 和 SDS 膠片中間是否有氣泡,若有氣泡必須趕走,最後吸出 running buffer 以 agar 進行封膠並使 strip 固定。 |
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6) 將 agarose 放入微波爐中溶解,吸取約 1 mL agarose 進行封膠,agarose 的溫度不可高於 60℃。 |
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7) 將上述處理好的膠體放入電泳槽,固定電壓 200 V 進行電泳約 4 h。 |
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2011 年全部講義 pdf |
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2011/07/15 |
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[Figure 1] 2-DE