2-DE Protocol

 
     
 
         
     

P2 二維電泳分析 2-D Electrophoresis 

 
         
     

儀器用具:

 
         
     

a) IPGphor, strip 及 holder (11 cm)

 
     

b) SDS 電泳槽 (Pharmacia Ruby) 及供電器

 
     

c) 微波爐

 
         
     

試劑藥品:

 
         
     

SDS 平衡 buffer:

 
     

Tris-HCl (最終濃度 50 mM)

(1.5 M)

10

mL

SDS

(2%)

4

g

Glycerol

(30%)

69

mL

Urea

(6 M)

72

g

Bromophenol blue

(0.01%)

200

mL


加水至 200 mL。

 
         
     

2-DE SDS 膠體溶液 [Table 2]

 
     

Solutions

5%

7.5%

10%

12.5%

15%

Monomer stock solution

16.7 mL

25 mL

33.3 mL

41.7 mL

50 mL

4X resolving gel buffer

25 mL

25 mL

25 mL

25 mL

25 mL

10% SDS

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

ddH2O

56.8 mL

48.5 mL

40.2 mL

31.8 mL

23.5 mL

APS 10%

500 mL

500 mL

500 mL

500 mL

500 mL

TEMED

33 mL

33 mL

33 mL

33 mL

33 mL







Total volume

100 mL

100 mL

100 mL

100 mL

100 mL

 
         
     

Monomer stock solution (30%T, 2.6%C):

 
     

Acrylamide (30%)

(FW 71.08)

60

 g

N,N-Methylenebisacrylamide (0.8%)

(FW 154.17)

1.6

g


加水至 200 mL。

 
         
     

Resolving gel buffer (4X):

 
     

Tris base

(1.5 M, FW 121.1)

181.5

g

ddH2O

 

750

mL


pH 調至 8.8 再加二次水至 1,000 mL。

 
         
     

Agarose (0.5%):

 
     

Agarose

 

0.5

g

SDS running buffer

 

100

mL


將兩者混合後,在微波爐加熱溶解。

 
         
         
     

操作步驟:

 
     

第一次元

 
     

1) 取以 sample buffer 溶解好的樣品 200 mL (11 cm strip holder 只能容納 200 mL),先將樣品放入 holder 中,再輕輕放入 strip gel,確定 strip gel 下無任何氣泡,最後覆蓋上 0.8 mL cover oil,防止 strip 乾掉或 urea 結晶

 
         
     

2) 使用 IPGphor system,先以 30 V 電壓將 strip rehydration 12 h,使 strip gel 膨潤,再進行設定的 program 如下: [Table 3]

 
     

電 壓

時 間

Vh

30 V

12 h

360

500 V

 1 h

500

1000 V

 1 h

1,000

8000 V

 2 h

16,000

 
         
     

3) 待 IEF 進行結束後,將 strip 以二次水清洗,以去除 cover oil,若無法立即進行 SDS 電泳分析,先將其放入 -80℃保存。

 
         
     

第二次元

 
     

4) 若立即進行 SDS 分析,夾出 strip 放入 5 mL SDS 平衡緩衝液 (加入 50 mg DTT),平衡約 12~15 min 後,再放入 5 mL SDS 平衡緩衝液 (加有 125 mg iodoacetamide) 平衡約 12~15 min,接著進行 SDS 電泳分析。

 
     

 

 
     

5) 將預先鑄好的 SDS 膠片從冰箱中取出,待其冷卻後再進行電泳檢測,先在膠體上層放入 SDS running buffer,使 strip 較好放入;strip 放入後檢查 strip 和 SDS 膠片中間是否有氣泡,若有氣泡必須趕走,最後吸出 running buffer 以 agar 進行封膠並使 strip 固定。

 
         
     

6) 將 agarose 放入微波爐中溶解,吸取約 1 mL agarose 進行封膠,agarose 的溫度不可高於 60℃。

 
         
     

7) 將上述處理好的膠體放入電泳槽,固定電壓 200 V 進行電泳約 4 h。

 
         
     
 
         
     

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2011/07/15

 

[Figure 1]  2-DE

 詳細時刻表