方法 P8

P8 螢光標定二維膠體電泳法

二維膠體電泳必須進行電泳圖譜的比對，然而就算相同時間進行的電泳，在不同的膠片上也會有些許不同，如此便增加了比對上的困難，若能將多種樣本，同時在同一膠片上顯示，便可以解決不同膠片或 strip 所產生的問題。於是將紅色與綠色螢光標定於不同的樣本，在一張膠片內進行電泳，由於不同波長光可激發出不同的螢光，因此可激發出不同的圖譜，如此更方便圖譜比對。

儀器用具：

1.5 mL 褐色微量離心管 (避光用)

Typhoon Imager (Amersham 60-0038-54) 必須到醫學院借用

試劑藥品：

標定螢光液：

CyDye (Cy3 或 Cy5)	(Amersham 25-1900-28, 30)	2	mL
Dimethylformamide (DMF)	(Aldrich 22,705-6)	3	mL

混勻後，可在 -15℃ 到 -30℃ 保存一星期。
◆ DMF 純度要高於 99.8% 且含水量要少於 0.005%；開封後保存不超過三個月。

終止標定液：

Lysine	(Sigma L-5626)	1.83	mg

加入 1 mL 二次水。

操作步驟：

1) 先將樣本定量到 50 mg 加入 1.5 mL 褐色微量離心管，使用 NaOH 將 50 mg 的樣本 pH 值調到 8.5。

2) 將 Cy3 標定螢光液加 1 mL 樣本 A 中；Cy5 標定螢光液加 1 mL 到樣本 B 中，於 4℃下避光反應 30 min。

3) 樣本 A 和 B 中，分別加入 1 mL 終止標定液，4℃下避光反應 10 min。

◆ 終止之樣本可於 -70℃下避光保存三個月。

4) 加入同樣本體積之 2X sample buffer，4℃下避光反應 10 min 後，將樣本 A 和 B 混合。

5) 接續二維膠體電泳法，進行 IEF 及 SDS-PAGE，全程避光。

◆ 鑄膠使用的玻璃片為特殊材質，必須為低螢光玻璃 (low fluorescence glass plates)；因為酒精內含螢光劑，所以鑄膠過程中，鑄膠玻璃不能使用酒精擦拭。

6) 將玻璃連同膠片一起放入 Typhoon Imager 中，進行螢光偵測。

2011 年全部講義 pdf

2011/07/15