2-DE Protocol

 
     
 
         
     

P3 膠體內水解 In-Gel Digestion 

 
         
     

儀器用具:

 
         
     

a) 膠片染缸及搖蕩器

 
     

b) SpeedVac 真空離心濃縮機

 
     

c) 37℃ 保溫箱

 
     

d) 超音波震盪器

 
         
     

試劑藥品:

 
         
     

蛋白質脫色液 (MALDI-TOF 或 LC-MS/MS):

 
     

NH4HCO3

(0.2 N)

1.94

 g

CH3CN

(50%)

50

g


加二次水至 100 mL。

 
         
     

酵素緩衝液:

 
     

NH4HCO3

(0.2 N)

1.94

g

CaCl2

(0.5 mM)

5.5

mg


加二次水至 100 mL。

 
         
         
     

操作步驟

 
     

還原

 
     

1) SDS-PAGE 經 CBR 染色後,以二次水清洗二次,每次 2 h

 
     

2) 將目標蛋白從膠片割下,放入離心管中,濃度需約 100 pmol。

 
     

3) 置於 100 mL 10 mM DDT/25 mM ammonium bicaronate, pH 8.5 緩衝溶液中,在37℃ 下反應 1 h,使雙硫鍵還原。

 
     

4) 10,000 rpm 離心 1 min 以去除 DTT。

 
     

5) 加入100 mL 100 mM iodoacetamide (IAA)/25 mM ammonium bicaronate, pH 8.5 緩衝溶液,於室溫避光反應 1 h。

 
     

6) 10,000 rpm 離心 1 min 以去除 DTT。

 
         
     

脫色

 
     

7) 加入脫色液 (25 mM NH4HCO3, 50% CH3CN),於 30℃ 反應 15 min,重複兩次。

 
     

8) 以二次水清洗兩次,以去除 CBR,最後以 SpeedVac 抽乾

 
         
     

In-gel digestion

 
     

9) 加入含有 0.1 mg trypsin 之酵素緩衝液 10 mL (25 mM NH4HCO3, 0.5 mM CaCl2),水解反應 10 min。

 
     

10) 加入 100 mL 酵素緩衝液,於 37℃下反應過夜。

 
         
     

萃取 peptide

 
     

11) 收集萃取液於離心管,加入 200 mL 萃取溶液 (0.1% TFA, 60% CH3CN)。

 
     

12) 在 35~40℃ 下超音波 30 min,收集萃取液於離心管中。

 
     

13) 用 SpeedVac 抽乾,最後以 20 mL 甲酸回溶

 
         
     
 
         
     

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2011/07/15

 

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