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P3 膠體內水解 In-Gel Digestion |
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儀器用具: |
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a) 膠片染缸及搖蕩器 |
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b) SpeedVac 真空離心濃縮機 |
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c) 37℃ 保溫箱 |
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d) 超音波震盪器 |
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試劑藥品: |
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蛋白質脫色液 (MALDI-TOF 或 LC-MS/MS): |
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酵素緩衝液: |
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操作步驟: |
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1) SDS-PAGE 經 CBR 染色後,以二次水清洗二次,每次 2 h。 |
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2) 將目標蛋白從膠片割下,放入離心管中,濃度需約 100 pmol。 |
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3) 置於 100 mL 10 mM DDT/25 mM ammonium bicaronate, pH 8.5 緩衝溶液中,在37℃ 下反應 1 h,使雙硫鍵還原。 |
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4) 10,000 rpm 離心 1 min 以去除 DTT。 |
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5) 加入100 mL 100 mM iodoacetamide (IAA)/25 mM ammonium bicaronate, pH 8.5 緩衝溶液,於室溫避光反應 1 h。 |
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6) 10,000 rpm 離心 1 min 以去除 DTT。 |
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7) 加入脫色液 (25 mM NH4HCO3, 50% CH3CN),於 30℃ 反應 15 min,重複兩次。 |
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8) 以二次水清洗兩次,以去除 CBR,最後以 SpeedVac 抽乾。 |
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9) 加入含有 0.1 mg trypsin 之酵素緩衝液 10 mL (25 mM NH4HCO3, 0.5 mM CaCl2),水解反應 10 min。 |
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10) 加入 100 mL 酵素緩衝液,於 37℃下反應過夜。 |
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11) 收集萃取液於離心管,加入 200 mL 萃取溶液 (0.1% TFA, 60% CH3CN)。 |
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12) 在 35~40℃ 下超音波 30 min,收集萃取液於離心管中。 |
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13) 用 SpeedVac 抽乾,最後以 20 mL 甲酸回溶。 |
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2011 年全部講義 pdf |
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2011/07/15 |
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