2-DE Protocol

 　
　 　 　
　
　 　 　 　 　
　 　 　

P1 樣本製備方法 Sample Preparation 

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

P1A 樣本蛋白質萃取法：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

儀器用具：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

a) 竹筍樣本、燒杯 (500 mL)

 　
　 　 　

b) 果汁機、紗布

 　
　 　 　

c) 高速冷凍離心機、離心管

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

試劑藥品：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

Tris buffer (50 mM):

 　
　 　 　

Tris-HCl  

(1 M)

25

mL

EDTA

(FW 292.2)

0.15

g

DTT 20 mM

(FW 154)

1.54

g

   [或 2-mercaptoethanol

(0.07%)

0.35

mL]

Benzamidine

(FW 156.6)

78.3

mg

Leupeptin

 　

0.5

mg

Pepstatin

 　

0.5

mg

調 pH 到 8.0 後，加二次水到 500 mL ，需新鮮配置。
　
　 　 　 　 　
　 　 　

TCA/acetone (10%):

 　
　 　 　

Acetone

 　

450

 mL

TCA

(100%)

50

mL

DTT

(20 mM)

1.54

g

   [或 2-mercaptoethanol

(0.07%)

0.35

mL]

共 500 mL。DTT 於使用前再添加。
　
　 　 　 　 　
　 　 　 　 　
　 　 　

操作步驟：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

1) 竹筍秤重 (約 50 g)，加入 1.5 倍 (v/w) 50 mM Tris-HCl 粗抽緩衝溶液 (含 1 mM EDTA, 1 mg/mL leupeptin, 1 mg/mL pepstatin, 1 mM benzamidine, 20 mM DTT)，以果汁機打碎竹筍樣品，靜置 30 min 後，以四層紗布過濾，再以 8,000 rpm 離心 30 min 後取上清液。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

2) 上清以三倍體積冰冷 10% TCA/acetone 溶液 (含 0.07% 2-mercaptoethanol 或 20 mM DTT) 沈澱蛋白質，混合溶液置於 -20℃ 靜置 45 min 至 1 h。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

3) 待蛋白質沉澱後，以 3,000~3,500 rpm 離心 10 min (懸籃式離心機)，取沉澱的蛋白質，再以純 acetone 懸濁清洗沈澱三次以上，以去除過多的鹽類。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　
　
　 　 　 　 　
　 　 　

P1B 蛋白質樣本溶解方法：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

儀器用具：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

a) 超音波震盪器

 　
　 　 　

b) 37℃ 水浴

 　
　 　 　

c) 微量高速離心機

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

試劑藥品：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

Sample buffer (25 mL):

 　
　 　 　

Urea

(6 M)

9

g

Thiourea

(2 M)

3.8

g

Triton X-100

(0.5%)

0.125

mL

加水至 25 mL，每 mL 分裝一管，置 -20℃ 存放。

使用前每管添加 10 mg DTT 及 5 mL IPG buffer (0.5%, pH 3~11或 4~7)。
　
　 　 　 　 　
　 　 　

操作步驟：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

1) 取 1 mg 樣本溶於 100 mL sample buffer 中，超音波震盪 1 h，於 37℃放置 3 h 以上，以增加溶解度。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

2) 若溶解不易，可以放置於冰箱過夜，再以 15,000 rpm 離心 15~20 min 後取上清液。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　
　
　 　 　

P1C 二次元電泳之蛋白質定量方法：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

儀器用具：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

a) ELISA 微量滴定盤

 　
　 　 　

b) ELISA 光度計

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

試劑藥品：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

Amersham Biosciences 2-D Quant Kit:

 　
　 　 　

     配製 Working color reagent (Reagent A : Reagent B = 100:1)，每樣本需 1 mL。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

標準校正線：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

以 BSA 為標準蛋白質，製作不同濃度的測試點，以畫出校正線。 [Table 1]

　
　 　 　

管 數

1

2

3

4

5

6

BSA 標準溶液 (2 mg/mL)

0 mL

5 mL

10 mL

15 mL

20 mL

25 mL

蛋白質量 (mg)

0 mg

10 mg

20 mg

30 mg

40 mg

50 mg
　
　 　 　

測定方法如同下述。

 　
　 　 　

操作步驟：

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

1) 取樣本液 10 mL 於 Eppendorf 離心管中，加入 500 mL Precipitant solution，震盪一下，室溫下靜置 5 min。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

2) 迅速加入 500 mL Coprecipitant solution，混合均勻，12,000 rpm 離心 5 min。

       注意：離心時要將 Eppendorf 的 hinge 朝外。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

3) 離心完之後，盡速吸出全部的上清液後丟棄 (若有些許上清液殘留，則再重複離心的步驟，以完全去除上清液)，保留完整沉澱。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

4) 沉澱加入 100 mL Copper solution 後，震盪一下，再加入 400 mL 二次水，將沉澱完全溶解。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

5) 快速加入 1 mL Working color reagent，混合均勻後，取 300 mL 注入 ELISA 微量滴定盤。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

6) 室溫靜置 10 min，使用 490 nm 波長測吸光值。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　

7) 與蛋白質標準校正線比較，以內插法計算出樣本液的蛋白質含量。

 　
　 　 　 　 　
　 　 　
　
　 　 　 　 　
　 　 　

2011 年全部講義  pdf  

   
　 　 　

2011/07/15

 　

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