NTU BioMed Bulletin

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何弘能  黃麗華  吳美玲  張明富  郭鐘金

● 台大醫學院  婦產科  何弘能 ●

骨盆腔細胞免疫力與子宮內膜異位

Peritoneal Cellular Immunity and Endometriosis

Hong-Nerng Ho 何弘能．Ming-Yih Wu 吳明義．Yu-Shih Yang 楊友仕

Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38: 400-412.

這次獲得國科會 88 學年度第一學期傑出研究獎勵，並不如第一次獲獎時那麼的喜悅。有點意外，更多惶恐，深深覺得肩上的壓力更大。研究的獲獎絕不可能是個人單獨的成就，而是整個團隊的努力和受肯定。

這幾年來我們的研究重點一直放在 (1) 早期妊娠時母體的免疫調適及著床的機轉 (85 年獲傑出獎的論文題目)，另外就是 (2) 子宮內膜異位症婦女骨盆腔內局部免疫力變化及其致病機轉。

摘 要

子宮內膜異位是良性婦科最常見，最棘手的疾病。長期以來我們就懷疑局部骨盆腔內細胞免疫力的變化，是本疾病致病的重要因子。本研究即針對子宮內膜異位症婦女，骨盆腔內的免疫力作一通盤探討，結果顯示子宮內膜異位症的婦女，骨盆腔內的吞噬細胞是被活化，能產生大量的 IL-10, IL-12 和 NO。進而影響到骨盆腔T細胞，T 細胞的活化抗原 CD25 顯著減少，製造 IL-2 和 IFN-g  的能力減少許多。其中 T 細胞被抑制的情況，又以 CD4 T 細胞為最，Th1 和 Th2 皆有被抑制的情形。這些免疫變化進而影響到 NK 細胞。骨盆腔內的 NK 細胞毒性顯著下降許多，而這些變化與子宮內膜異位的嚴重程度成反比。經過 GnRH agonist 等藥物治療，這些免疫變化可以恢復，而且與臨床症狀的改善有很好的相關性。由於這些研究。我們提出對子宮內膜的病理生理學，如圖示的假說。 

方 法

以子宮內膜異位婦女的周邊血液及骨盆腔液內免疫細胞進行詳細的 immunophenotyping。以不同單株抗體測試不同免疫細胞的表面抗原，和各種活化抗原。RT-PCR 直接測試周邊血液及骨盆腔內免疫細胞內不同細胞素 mRNA 的表現。不同免疫細胞體外培養，在 PHA, Con A, LPS 等刺激或不刺激下，利用 ELISA 測定培養液及活體內骨盆腔液不同細胞素的濃度。以 ⁵¹Cr assay 測定細胞毒殺能力。

展 望

以此建構骨盆腔內免疫力變化對子宮內膜異位致病原因的可能機轉，進一步建立可能的動物模式，研究不同免疫療法或藥物對子宮內膜異位臨床上的價值。並進一步探討免疫能力變化與 ectopic endometrial tissue implant, invasion 和 growth 間的關係。

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● 台大醫學院  肝炎中心 黃麗華 ●

腦內施打細胞激素改造過之腫瘤疫苗可造成原位腦腫瘤的清除

Regression of Orthotopic Brain Tumors by Cytokine-Assisted Tumor Vaccines Primed in the Brain

Sheng-Hong Tseng 曾勝弘．Chia-Ling Hsieh 謝嘉玲．Swei-Ming Lin 林瑞明．Lih-Hwa Hwang 黃麗華

以這次這篇論文獲得傑出獎，真是令我自己頗感意外，因為之前連續好幾年，以更佳之代表作申請，充其量都只是『傑出獎候選人』的份，最後都還不是中箭落馬，怎麼可能這次反而有機會呢？ 唯一最好的解釋是，評審委員大概在磨練我們的持久力！ 單靠一兩次的好論文，他們可能認為火候還不夠吧！ 故以此經驗，與有意問鼎傑出獎的同仁們共勉之，千萬別鬆懈了，媳婦總會熬成婆的。

我個人實驗室從事兩方面的研究，一是有關 C 型肝炎病毒 (HCV) 之分子生物，另外則是癌症之基因治療。HCV 的研究課題是一個頗具競爭的領域。我們算是較早對 HCV 之 NS3 解螺旋進行研究的實驗室。對它的生化特性及結構曾做過詳細的分析。目前並與陽明廖淑惠老師及藥學系陳基旺老師合作，希望藉由它的結晶結構著手，進行抗病毒藥物的篩檢及設計。至於其他有關 HCV 的研究，尚包括有病毒轉譯的調控，HCV 抗細胞凋亡機制等之探討。在這方面的研究，我希望除了對其基本的病毒分子生物學有更深入的了解外，也希望能帶入一些臨床上的應用，以協助解決目前 C 型肝炎的問題。

基因治療相關研究在我實驗室已從事多年。早期我們以建立反轉錄病毒載體為主，著重在載體的設計和使用，隨後應用它在生長激素缺乏的疾病上的治療。至今，我們則利用基因治療的方法，嘗試進行腫瘤的治療。首先我們選擇細胞激素 (cytokine) 之免疫療法策略於淋巴癌、肝癌及腫瘤方面的研究。在老鼠動物模式中，我們發現免疫療法的一些缺點及限制，即它只能對小腫瘤有明顯治療效果，但對大腫瘤則完全無效。我們目前除了進一步了解其治療不成的一些原理機制外，也同時積極地再去尋找一些其他的策略，希望未來能與免疫療法合併使用，以增加治療大腫瘤的機會。

這次獲獎的主要論文，就是與神經外科曾勝弘醫師合作之題目。利用上述細胞激素之免疫療法，我們嘗試進行腦腫瘤的治療，當然也碰到一些如上所述之瓶頸。不過我們隨後發現一些合併療法有加成效果 (見論文摘要)。未來，我們仍然會在實驗室內繼續研發不同的策略，並與臨床醫師合作，希望將來真有一天能將基因療法應用在人類癌症治療上。這些種種的期待和希望，都有待於我的學生和助理們，一步一步的來加以完成。當然也歡迎有興趣的同學或醫師們的參與，以共同來達成此目標。

摘 要

 本實驗研究將一個腦腫瘤細胞經遺傳工程方法改造使之會分泌 GM-CSF 細胞激素後，將之用為腫瘤疫苗，打入大腦內，看看能否具有治療原位腦腫瘤的效果。結果發現不論以活的或輻射過之腦腫瘤疫苗打在大腦內均能引起免疫反應。但這個免疫反應只對小腫瘤有效，對較大腫瘤或存留較久之腫瘤則效果較差。免疫染色分析結果發現確有不少顆粒狀細胞，巨噬細胞， CD4⁺ T 細胞及 CD8⁺ T 細胞存在施打腫瘤疫苗地方及野生型腫瘤生長的地方。隨後我們亦發現大腦瘤可藉由下列一些策略上的改良，大大增加其被治療的效果：諸如提高腫瘤疫苗的劑量，或合併會分泌 GM-CSF 與分泌 IL-2 之腫瘤疫苗使用，或合併會分泌 GM-CSF 腫瘤疫苗與會表現 HSV-tk 基因之腫瘤細胞，同時再加上 ganciclovir 的處理，共同使用。這些合併策略，都能產生加成的效果，故而對大腫瘤亦產生相當好的治療效果。我們的實驗結果認為細胞激素的免疫療法對於治療大腦內的腫瘤應是一個有潛力的治療方法。

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● 台大醫學院  生理學科  吳美玲 ●

小腦顆粒神經細胞在代謝抑制下引起胞內鈣及鈉離子上升機制之探討

Early Metabolic Inhibition-Induced Intracellular Sodium and Calcium Increase in Rat Cerebellar Granule Cells

Wei-Hao Chen 陳惟浩．Kuan-Chou Chu 朱冠州．Shyh-Jong Wu 吳世忠．Jiahn-Chun Wu 吳建春．Hao-Ai Shui 稅皓靄．Mei-Lin Wu 吳美玲 

J. Physiol. (London) 1999, 515: 133-146.

至今我仍記得在二十多年前在大三的第一堂生理學課中，萬家茂老師的一段話：生理學乃是研究人體如何利用 negative feedback system 使各器官系統巧妙地維持在一種衡定 (homeostasis) 的狀態。我目前之研究主題乃以細胞層次為主，利用各種離子之螢光標的物質  (fluorescent dyes)，探討細胞內幾種重要離子 (包括鈣、鈉、氫離子) 之調控機制。當調控機制異常時，即無法維持細胞 microenvironment 之平衡狀態，此時細胞多半進入一種 positive feedback 的惡性循環，終使細胞受傷或死亡。細胞如何調控這複雜的 microenvironment？ 一般乃依賴各種細胞膜及胞器膜之上的 transporters 及 active pumps。 例如圖一在神經細胞膜上、內質網及粒腺體的膜有對各種對外來刺激可作反應的離子通道 (channels 可看成小孔) 及各種 transporters 或 active pumps (為 transmembrane proteins)。以鈣離子為例，它可經由外在一些訊號 (例如 neurotransmitters) 打開 channels (例如 NMDA 及 Ca²⁺ channels) 進入細胞後進行其 signal transduction 之任務。但如何再使其回復平衡則是利用細胞膜上之 Ca-ATPase (即是 Ca_i-H_o exchanger), Na_o-Ca_i exchanger 排出胞外，及 ER 上之 Ca-ATPase 及 mitochondria 內膜上之 Ca²⁺ uniporter 吸收入胞器中。由最近研究顯示，當細胞質內 Ca²⁺ 上升時，核內之 Ca²⁺ 也會隨之上升，此種現象可能與下游的各種 Ca-dependent gene expression 有關。以鈉離子為例，它進入神經細胞的方法可由 Na⁺ channels, NMDA channels, Na/K/Cl cotransporter, Na_o-Ca_i exchanger 及 Na-dependent pH transporter。排出胞外方法可由 Na/K ATPase, Na_i-Ca_o exchanger (Na_o-Ca_i 可逆轉) 或由粒腺體內膜上之 Na-Ca exchanger (即粒腺體內之鈣與細胞質內鈉交換) 去吸收。

由於新的技術不斷引進生理學領域，由以前的系統生理學至細胞生理乃至分子生理學之研究。因此在將來的研究中，如何能更進一步與生化及分子生物的技術相結合，對各種離子調控機制在分子階層能進一步解析，是我個人所須努力的方向之一。但不可忘記的事，我們在各個分子、細胞層次所得之結果，最終仍須回歸至系統生理得層面，才能對增進人類的健康有實質的意義。

我個人在研究所所開之課程，乃以最近幾年有關上述各種膜上構造的論文作詳細講解，使新的研究生對基本的離子的調控有概念，之後則是由研究生輪流報告與自己研究主題相關的論文。我個人上課方式主要以討論之型式，即不斷的將論文內容以問題的型態加以討論，使修課的人能有思考的機會，一旦深入了解，即會印象深刻，並且此種方式可使研究生在進行自己的研究時，會不斷地發掘及思考問題，但負作用是不斷地發問使學生覺得壓力大。以下即簡介最近之研究主題之一。

摘 要

一般神經細胞必須藉助著多種的機制 (如圖一)，共同維持細胞內鈣、鈉離子之衡定。例如在腦缺血 (ischemia) 或代謝抑制 (metabolic inhibition) 下，會出現細胞內鈣離子、鈉離子上升等失衡現象，在臨床上已知，brain ischemia/hypoxia 時鈣離子長期增加可引起神經細胞損傷，而鈉離子大量上升亦可使神經細胞有 edema (水腫) 之現象。

圖一  細胞膜及細胞內胞器上與 ion homeostasis 有關之構造，包括 channels, transporters 及 pumps。 圖上各縮寫全名如下： PLA₂ (phospholipase A2), AA (arachidonic acid), LPC (lysophosphatidylcholine)。

至於引起神經細胞因缺氧及缺血導致胞內鈣離子增加的原因，前人提出了以下數種理論，包括 (i) voltage-gated Ca²⁺ channels 的活化，(ii) NMDA/non-NMDA channels 的活化，(iii) Na_i/Ca_o exchanger 之逆向運轉，(iv) Ca-ATPase (即是 Ca_i-H_o exchanger) 受到抑制，以及 (v) 產生過量的 free radicals。引起細胞內鈉離子增加的原因有 (i) voltage-gated Na⁺ channels 的活化，(ii) Na/Kl 2Cl cotransporters 的活化，與 (iii) Na_o/Ca_i exchanger 的正向運轉。由於各家結果並不一致，因此本研究乃利用 microfluorimetry 研究大鼠小腦顆粒細胞中由代謝抑制 (缺氧/缺血所造成的結果之一) 引起細胞內鈣離子、鈉離子上升的機制。 

將 glycolysis 及 mitochondria 合成 ATP 之代謝途徑加以抑制，我們發現在代謝抑制之早期  (30 分鐘內) 引起二階段的鈣離子上升，第一階段來自 mitochondria 中鈣離子的釋出 (這是前人所未見的)，第二階段則由於細胞外鈣離子大量進入細胞內。我們證明了鈣離子大量由胞外進入之途徑不是由於排鈣或吸收鈣的機制受到抑制 (如 Ca-ATPase 排鈣及 mitochondinal 吸收鈣)。其它前人之假說也一一排除，我們的結果顯示，乃經由 Ni²⁺-sensitive 的未知離子通道。另外，我們也觀察到鈉離子濃度也會大量增加，也是由胞外鈉離子大量進入細胞所引起 (這是前人未能直接測到的現象)，其進入途徑也是由一種 Ni²⁺-sensitive 的未知離子通道所引起 (請參考圖一)。

最後我們證明代謝抑制會活化 PLA₂ (phospholipase A₂，這亦是以前未知的)，它活化後產生了 AA (arachidonic acid) 及 LPC (lysophosphatidyl choline) 而引起鈉/鈣離子上升，可能是由於 PLA₂ 活化，造成 membrane lipid 崩解釋放出 AA 及 LPC，之後再活化一種未知的 Ni²⁺-sensitive 孔道使胞外鈉/鈣離子進入細胞內。 

方 法

 利用顯微螢光測定術 (microfluorimetry)，以 Fura-2AM 或 SBFI-AM 等螢光顯示劑分別連續測量在各種處理下細胞內鈣離子與鈉離子的變化。

展 望

1. 本研究清楚顯示在神經細胞代謝抑制後，PLA₂ 的可逆性活化使細胞內鈉/鈣離子大量上升，扮演了關鍵的角色。因此若能及早調控抑制 PLA₂ 的活性，理論上可以減少因 PLA₂ 活化引起的細胞膜崩解與細胞內離子失衡，所造成的神經細胞損傷與水腫。在臨床上治療腦中風的患者是一個值得再探索的方向。

2. 腦缺血或代謝抑制引起的離子失衡，還包括細胞內酸化現象，此種酸化對於細胞損傷是否具有保護作用，值得我們進一步研究。

3. 此外，最近有部份研究指出細胞內鈣離子增加與細胞核內酸化可以增加某些基因表現，因此這也將來深入探索的重要方向。我們目前利用 confocal microscopy 之技術，已觀察到 PLA₂ 活化使 AA 上升後，AA 可引起的細胞質與細胞核內的鈣、氫離子之上升，由於已知核內鈣/氫離子濃度會影響基因表現，因此如何配合分子生物的技術，進一步了解這些現象代表的意義與機轉，對於以後疾病的預防與治療，將有極為重要的影響。

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● 台大醫學院  生化科  張明富 ●

位於 spike 蛋白質 S1 次單元超變異區內之 12 個胺基酸對於鼠肝炎病毒至細胞融合活性具重要性

A 12-Amino Acid Stretch in the Hypervariable Region of the Spike Protein S1 Subunit Is Critical for Cell Fusion Activity of Mouse Hepatitis Virus

 Chang-Wu Tsai  蔡倉吾．Shin C. Chang 張鑫．Ming-Fu Chang 張明富

 J. Biol. Chem. 1999, 247: 26085-26090

 本人很榮幸接受本刊物之邀稿，在此扼要介紹回國 10 年來之研究成果，希望未來能為生物醫學領域做出更多之貢獻。我們實驗室的研究興趣主要在探討肝炎病毒之生活史及其致病機轉。D 型肝炎病毒會引起嚴重的慢性肝炎，甚至猛爆性肝炎。C 型肝炎病毒則常會造成持續性感染且與肝細胞癌的形成有關。本實驗室主要利用 D 型肝炎病毒 RNA 複製及組合之系統用以探討病毒抗原及宿主細胞因子參與 D 型肝炎病毒的生活史。還有關於 C 型肝炎病毒轉譯及核心蛋白質如何致肝細胞癌之分子機轉。希望透過對這些病毒之瞭解，能找出抗肝炎病毒之新方法。      

D 型肝炎病毒約 36 nm，是目前所知含有最小 RNA 基因體之人類濾過性病毒。它以 B 型肝炎病毒的表面抗原作為外套，而在病毒顆粒內含有兩種具有相同 N 端的蛋白質組成，分別是大型 (214 amino acids) 及小型 (195 amino acids) 的 D 型肝炎抗原，以及一長度約 1.7 kb 的單股環狀 RNA 基因體，此病毒 RNA 具有切斷本身 RNA 的酵素功能，為一種 ribozyme。此一特性對於 D 型肝炎病毒 RNA 的複製是相當重要的。 近年來，我們已成功的利用 D 型肝炎病毒的 cDNA 或 RNA 轉染肝及非肝細胞株，建立了病毒複製系統，並利用點突變和刪除方法證明 D 型肝炎抗原之 coiled-coil structure, nuclear and nucleolar localization signals, helix-loop-helix structure 及 proline-glycine-rich domain 等功能區對於小型的 D 型肝炎抗原幫助病毒複製及組合上的重要性。同時，coiled-coil structures 對於大型的 D 型肝炎抗原在抑制病毒複製及協助小型的 D 型肝炎抗原進行病毒顆粒組合是重要的。至於病毒 RNA 的組合方面，我們亦已證明 D型肝炎抗原之 RNA-binding domain 及大型的 D 型肝炎抗原 C 端的 19 個胺基酸，其中包括 isoprenylation site 及 nuclear export signal 佔重要角色。而 RNA介於 nucleotides (nt) 654 和 965 間的 312 nt 區域中含有 packaging signal，由此 312 nt 所形成之類桿狀構造 RNA 可與 D 型肝炎抗原形成 ribonucleoprotein complexes (RNP)，並被包裹出來。宿主細胞因子 nucleolin 證明與 D 型肝炎抗原結合並位於核仁，對於病毒複製是重要的。而 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 證明與 D 型肝炎病毒 RNA 結合，且對於 antigenomic RNA 之 ribozyme  活性有加強之效果。由以上的這些結果顯示，D 型肝炎抗原各功能區及宿主細胞因子在早期病毒感染時之 RNA 複製以及晚期病毒之組合上分別擔任不同的角色。B 型肝炎病毒雖然是 D 型肝炎病毒在感染時及組合時之輔助者，但對於 D 型肝炎病毒 RNA 之複製是不需要的。這些研究結果有助於未來建立對抗肝炎病毒之基因治療法。 

C 型肝炎病毒約 55 nm，為黃病毒科之一種濾過性病毒。病毒顆粒內含有一長度約 9.5 kb 的單股正向直線型 RNA 基因體。C 型肝炎病毒的轉譯作用是利用 internal initiation 的方式進行。本研究室發現病毒 RNA 介於 131 和 278 間的 148 nt 區域可與蛋白質 p120 結合，並利用 in vitro translation 系統之競爭性實驗證明 p120 很可能參與 C 型肝炎病毒的轉譯之起始功能。另外，我們亦構築 b-galactosidase 與核心蛋白質的表現質體以合成融合蛋白質並配合細胞染色方法證明 C 型肝炎核心蛋白質有三個獨立的核位訊息。近來，本院微生物所張鑫老師與我們合作，發現 C 型肝炎病毒 RNA 複製酵素可專一性結合 HCV 3' RNA。 此一結果，可部份解開 HCV antigenomic RNA 合成起始之謎。

除了人類肝炎病毒之研究外，國內研究動物有一相當比率受老鼠肝炎病毒 (MHV) 之感染而影響研究品質。因此，我們亦對研究 MHV 特別是其融合現象也有高度興趣。經由分子選殖，活性分析及 domain swapping 實驗，證實在 MHV 之 spike 蛋白質的 S1 subunit 之多變異區中有 12 個胺基酸對於細胞之融合活性相當重要。此一新發現有別於過去的研究認為 S2 subunit 及 proteolytic cleavage 對於細胞融合活性才是重要的說法。

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● 台大醫學院  生理學科  郭鐘金 ●

不同抗癲癇藥物在神經元鈉離子通道上之一共同結合位置

A Common Anticonvulsant Binding Site for Phenytoin, Carbamazepine, and Lamotrigine in Neuronal Na⁺ Channels

Chung-Chin Kuo 郭鐘金

Molecular Pharmacology 1998, 54: 712-721.

摘 要

Phenytoin, carbamazepine 及 lamotrigine 為臨床上常用之抗癲癇藥物。 這些藥物皆會抑制神經元上之鈉離子電流。 此抑制作用與細胞膜電位有關， 且很可能即為此等藥物之抗癲癇作用之主要藥理機轉。 本論文詳細探討了當這三種藥物中之兩種，或三種同時存在時，對鈉離子電流之抑制作用。 其中對鈉離子通道不活化曲線位移之定量分析， 顯示一個鈉離子通道不可能同時被兩個藥物分子所結合。 此外，當一個快速恢復藥物與另一個恢復較慢之藥物相混合後，鈉離子通道由此混合藥物之抑制作用中恢復過來的速度，比由單一個恢復較慢之藥物之抑制作用中恢復過來的速度還要快 (或至少是不慢)。 此一反應速率上之重要觀察，亦強烈顯示當一藥物分子結合到鈉離子通道之後，其他藥物分子即不能再結合上此一通道。 本論文也指出這些藥物僅在由細胞外投予時可以抑制鈉離子電流；而若改由細胞內投予，則對鈉離子電流並無作用。 依據上述諸項發現，這三種抗癲癇藥物應係結合到鈉離子通道上之同一位置，且此一共同結合區可能乃位於鈉離子通道之外表面。由這些藥物之共通結構，可以大致推估出鈉離子通道上之此一抗癲癇藥物結合位置之關鍵結構。 而且因為這些藥物對處於不活化狀態之鈉離子通道之親合力皆遠大於對休息狀態之鈉離子通道之親合力，此一抗癲癇藥物共同結合區可能應只存在於不活化狀態，而不存在於休息狀態之鈉離子通道。 因此對於此一結合區之研究，可能也將對鈉離子通道蛋白開關時之形態變化，提示一些有趣的思考方向，以待來日進一步之驗證。

研究相關領域

以 patch clamp 等電生理技術，來探討有關離子通道 (ion channels) 之門閥開關機轉，以及離子通透等性質。而基於個人對神經系統的興趣，研究領域尤其側重於對神經細胞上之各種離子通道運作機制之了解。由於離子通道為造成細胞電生理活動之主要基石，希望這些有關離子通道之分子生理學與分子藥理學方面之探索，能夠使我們更瞭解細胞電生理活動之生成與調控機制，同時也能夠幫助大家更有效地使用各種藥物來改正細胞之病態電生理活動。目前開設課程有：細胞神經生理學，高等細胞神經生理學等。

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