NTU BioMed Bulletin

回目錄

二十一世紀基因分析的利器︰

基因微陣列之簡介及其應用

陳 健 尉

圖一   圖二   表一   References

科學家預計於西元 2003 年，媲美 60 年代登月計劃的人類染色體組研究計劃將結束其長達約十五年的漫長發展過程 ⁽¹⁾。屆時，人類四十六條染色體九成五以上將定序完畢 (解開遺傳密碼)，大部分的模式生物 (model organisms) 亦可望完成定序工作，全球的生命科學家也隨著這一天的到臨而雀躍不已，個個摩拳擦掌整裝以待進入另一個令人期待的世紀，即後染色體組世紀。

定序完成只是提供讓人一窺遺傳密碼全貌的機會，欲瞭解基因、應用基因，最重要的是了解其功能，它的作用是甚麼。人類估計約有十萬個可表現的功能基因 (functional genes) ⁽²⁾ 控制著人類生長、發育、遺傳、行為及疾病等等生理現象及生化反應 ⁽³⁾，其中約 90% 是不知道功能的，如果定序的結果是一本電話簿，那麼裡面有九成是只有電話號碼和住址而沒有姓名。因此，探索基因的功能及其間的交互作用，是為後染色體組世紀的最重要工作之一。尋找基因、探索其功能一直以來是分子生物學家的夢靨，但卻也是從事分子生物及遺傳學研究的基礎。花費數年，終究功虧一簣的大有人在，且一次只針對一個或少數基因研究，對大部分未知功能的人類基因而言，這似乎是一條遙遠而崎嶇的長路。

近年來基因晶片技術的崛起，不僅提供了解決上述基因研究上的問題，也帶動了全球基因功能分析自動化的風潮，加速了功能基因研究的進度。其不僅對基礎研究造成深遠的影響，同時也對生物科技產業產生微妙的效應，預期一場基因科技革命即將展開，而人類是這波革命下的最大受益者。

主宰生長、發育、自動調節 (homeostasis)、行為及疾病的發生等錯綜複雜、迂迴曲折的現象，大大地受同源的基因所編譯之核醣核酸及蛋白質所支配，也受到基因的複雜性及基因與周遭環境動態的交互反應所主宰。簡單的基因調節網絡之複雜性，如在噬菌體中決定 lytic 或  lysogenic pathway 的過程，突顯出其概念上無法適用於高等真核生物。此乃因其利用包括數以千計的基因所組合成的數百個遺傳途徑。為解開這複雜的基因網絡以瞭解生物的各種生命現象，就必須從許多基因的功能著手，這也意味著人類染色體組計劃的結束將開啟另一個新紀元，即後基因組世紀的來臨 ⁽⁴⁾。功能基因分析亦被喻為繼人類染色體組計劃後，二十一世紀最具潛力的研究主題之一。

基因為一切生命現象的基礎，回顧過去幾十年來應用於篩選差異表現基因的方法，例如差異性篩選法 (differential screening) ⁽⁵⁾、蛋白質序列推衍法 (oligonucleotide probe derived from protein sequence) ⁽⁶⁾、免疫篩選法 (immuno-screening) ⁽⁷⁾、刪減篩選法 (subtractive screening)、演化保存區域篩選法 (conserve region between species or gene family) ⁽⁸⁾ 及差異性顯示法 (differential display) ^{(9, 10)}。這些方法，如刪減篩選法，或可單獨進行或可結合其他實驗步驟以使篩選基因更加有效率 ⁽¹¹⁾，但仍須耗費大量人力、物力及時間。而差異性顯示法雖然簡易、有效，但往往經過 40 cycle 的 PCR 反應，實驗結果會得到偽陽性訊號 (false positive)，且無法獲得較完整的 DNA 片段或序列訊息，以行更進一步的實驗。在監測 (monitoring) 基因表現上，傳統的方式是以北方墨點雜交法，一次一個或少數個基因來進行實驗。對於多基因參與的生化過程或基因網路而言，則需花費相當長的時間才可能完成，或甚至無法進行。

近年來，有三項主要的科技被發展來大規模篩選並監測基因的表現︰ (a) cDNA microarray:  由 P. Brown 等人 ^(12-14) 所發展，其乃將經由聚合脢聯鎖反應且純化之基因片段以微陣列方式配合化學方法，將 DNA 固定於載玻片上。以兩種核酸探針分別標示上不同波長的螢光分子與載玻片上的基因進行雜交反應。經過雷射光的激發及掃瞄後 ^{(15, 16)}，放射出來的兩種波長的螢光可同時被收集並數位化，以用來估量基因表現的程度。 (b) Serial Analysis of Gene Expression (SAGE): 由 Kinzler 等人 ^{(17, 18)} 所發展，此方式利用特殊限制脢 (Fok I 及 Nla III) 及聯結子 (linkers) 以形成一連串的聯結序列 (serial link tags)，然後使用對聯結子具專一性的引子 (primer) 進行聚合脢聯鎖反應。 最後將這些增殖的基因片段作定序的工作。藉由許多聯結子所包圍產生之九個核甘酸 cDNA 序列出現的機率，可用來估計基因表現的程度。 (c) DNA 晶片 (chip) 方法 ^(19-21)，其概念源自寡核脢酸陣列 (oligonucleotide arrays)，為九○年代初期發展於定序的新方法。其主要為在玻璃或矽晶片上直接合成特定序列的寡核甘酸，再以標記螢光分子的探針與之雜交，並分析那些寡核甘酸序列有雜交反應發生，並以電腦重組這些序列。這幾年來則改變應用方向於可快速並同時定量許多基因表現的程度 ⁽²²⁾。在 1.28 cm × 1.28 cm 的晶片上約可合成 409,000 個寡核甘酸，可代表約 10,000 個基因。 DNA 晶片的相關訊息、生物科技公司及進一步資料，可經由網址 http://www.affx.com 獲得。除上述三項之外，還有一些高密度 cDNA 陣列的方法也被發展來定量多數基因的表現 ^(23,24)。 如生物科技公司 Genome Systems，在 22 cm × 22 cm 的薄膜上可佈放 18,394 個 EST 菌落，其他相關資料可由該公司網址查詢 (http: //www.genomesystems.com)。

何謂基因微陣列、DNA 晶片、基因晶片或生物晶片？ 以製程及承載基因之材料而言，可分為陣列方式及晶片方式兩種，如附 圖一。 前者為將經聚合脢鏈鎖反應增殖之片段或合成之寡核甘酸，以精密儀器佈放至尼龍薄膜或玻璃載玻片上，即微陣列 (microarray) 或稱基因微陣列，製作陣列方式的晶片費用較低，也較能為一般實驗室所採用，其製作流程如 圖二；而後者是利用半導體製程及化學合成技術，直接在矽晶片上合成寡核甘酸，即所謂的 DNA 晶片 (DNA chip)，其製程複雜且所費不貲，並不適合一般實驗室發展應用。 在目前的認知上，將上述兩者 (microarray 及 DNA chip) 均統稱為基因晶片或生物晶片 (biological chips)，蘊含有於一小範圍的承載物 (薄膜、玻璃或矽晶片) 上，可同時獲得大量的基因或生物訊息之意函 ⁽²⁵⁾。另有科學家發展一種具微管路的晶片，血液或樣本通過管路，可自動分析其中所含之化學成分，與上述所稱之晶片是不同的 ⁽²⁶⁾。

圖 一

何謂 基因微陣列、DNA 晶片、基因晶片或生物晶片？ 以製程及承載基因之材料而言，可分為 陣列方式 (圖一上) 及 晶片方式 (圖一下) 兩種。

圖 二

微陣列 (microarray) 或稱 基因微陣列 將經聚合脢鏈鎖反應增殖之片段或合成之寡核甘酸，以精密儀器佈放至尼龍薄膜或玻璃載玻片上。

晶片偵測技術上，以薄膜為基因承載物者，可利用免疫酵素顯色分析，這是由中央研究院生醫所白果能博士實驗室自行開發微陣列系統及顯色方法 ⁽²⁷⁾，因其使用方便、物美價廉，為目前國內使用率最高者。 另法國馬賽大學癌症免疫研究所 Jordan BR 則利用放射線同位素 (³³P) 及特殊設備 (Biospace Micro Imager)，使訊號不致在 X 光片上暈開，亦可應用於微陣列 ⁽²⁸⁾，惟基因間佈放相對位置需達 500 mm 以上且放射顯像時間長達三天，顯色分析及螢光偵測則可小於 200 mm。 以玻片及矽晶片為基因承載物，如 Brown 及 Affymetrix 所發展之晶片，則僅能以螢光偵測。免疫酵素顯色、放射線同位素或螢光偵測各有其優劣點，惟目前僅免疫酵素顯色法及螢光偵測法能適用於較高解析之晶片，且能有多重顏色的變化，也適合於一片晶片而多個樣本之研究。

就偵測之靈敏度而言，以放射線同位素較高，而免疫酵素顯色較差，各種偵測法靈敏度之比較如表一所示。其中，免疫酵素顯色法經訊號放大 ^{(29, 30)} 或核醣核酸增殖反應 (RNA amplification) 後 ⁽³¹⁾，其靈敏度將可提高 200 倍，偵測靈敏度甚可超越其他兩法。更重要的是，此法是最經濟方便的方法，任何實驗室均能在適當的技術指導下，設立此一方法，既能保證晶片的品質，也能兼顧科學方法一般普遍性的原則。

表 一

隨著大量基因資訊的獲得，另一類的生物資訊學─大量基因資料分析與統計，遂逐漸形成重要的研究工具之一。目前的趨勢傾向於將訊息進行歸類、分析比對，即所謂的叢集分析(cluster analysis)。 所利用的方法，從 UPGMA 叢集法 (unweighted pair-group method using arithmetic averages 或稱 average linkage clustering method) ⁽³²⁾ 至 SOM (self-organizing map) ^(33,34) 等不勝枚舉，在此提供文獻中分析方法的一般性原則，以為欲從事基因晶片分析研究者參考。期能發揮創意，發展一套大家均適用的方法，以加速此類研究的進展。

一、縝密的實驗設計︰ 如加入植物基因，以供校正樣本間 (membranes or chips) 不可避免之實驗因素所造成的誤差；即縮小同一實驗中不同晶片間的差異。

二、資料標準化 (standardization)︰使不同基因間在同等地位中做比較，不因某基因數值大而影響整個分析趨勢，即以基因表現的型態 (shape) 為分析標準，例如可令 Zij = (Xij-Xi bar) / Si並使 Zibar = 0, S'i = 1。

三、相似係數之擇定 (resemblance coefficients)︰ 選擇計算係數公式，如 average Euclidean distance coefficient。

四、資料過濾之擇定 (filtering data)︰ 除去不適當的資料，如除去表現值在臨界值 (threshold) 以下的基因。

五、叢集分析法之擇定 (clustering method)︰ 如以 UPGMA 叢集法，將基因之相似係數做叢集歸類。

以上所提之各點原則均是活用且具彈性，僅供參考，詳細內容可參考各相關文獻 ^(32-34)。

以基因晶片進行雜交反應以獲得訊號，需釐清一些觀念。傳統的雜交反應，在薄膜上的核酸分子稱為標的物 (target)；加入雜交反應袋內與薄膜行雜交反應之標記核酸稱之探針 (probe)。而在基因晶片雜交反應中，於薄膜或其他承載物上的核酸，因每一點代表一基因，故稱其為探針；加入與之雜交的核酸，因是由整個訊息核醣核酸經標記作用後而來，則稱之為標的物。這種雜交方式與之前即已發展之反向圓點墨點法 (reverse dot blot) ⁽³⁵⁾ 是相同的，不同的是基因晶片是微型的反向圓點墨點法 (micro-scale)。

因此，事實上我們沿用一二十年的圓點墨點法 ⁽³⁶⁾，即是陣列式基因晶片的前身，只是隨著分子生物技術的突破、精密儀器的發展及自動化設施的配合，原本 630 × 990 mm的大小可縮減為 1.4 × 2.2  mm，甚至更小，面積縮小了約 20 萬倍。正因如此，同時在一小範圍偵測數以萬計的基因成為可能，所須之生物性材料，如探針及標的物也減少，自動化流程也完全可能實現。以二十年前圓點墨點法的技術，很難想像今日基因晶片發展的規模。

基因晶片之所以能成為本世紀最受矚目的功能基因研究工具之一，乃其具有 (1) 大量樣本；(2) 同時進行；(3) 自動化分析等三項特點及 (1) 基因定量；(2) 差異基因搜尋兩項基本特質，交互運用而衍生出許許多多應用，不僅於生物醫學上，在微生物及植物界也同樣具有廣大的應用範圍。以下僅列舉數個目前及未來可能的應用範圍以為參考，甚而能激發靈感，開拓未可知的研究領域：

一、差異表現基因的篩選： 例如比較正常細胞與癌細胞之差異，可大量篩選腫瘤標記基因 (tumor marker) 或應用於具不同癌轉移能力之細胞株以獲得癌轉移相關基因 ^(37-39)。

二、細胞週期基因表現的研究： 剖繪細胞週期中不同時期基因之表現，並探索細胞從靜止期 (G₀) 回到生長週期的關鍵基因，以發展使停止生長的細胞重新生長的方法 ⁽⁴⁰⁾。

三、基因突變之解析： 例如利用寡核甘酸晶片快速定出基因突變的位置及序列 ^{(41, 42)}。如利用 P53 晶片進行臨床篩檢，作為被篩檢者是否列為癌症高危險群的參考依據 (Affymetrix 公司推出)。

四、藥物開發及藥理學研究： 利用這項技術可篩選開發出來的藥物是否可抑制某些致病基因或誘導抗病基因的表現，而不影響其他維持正常生命功能之基因的表現。如此將可更準確的篩選及預測新藥的功能，並大幅縮短藥物開發的時程，如動物及人體試驗，或提高臨床人體試驗的安全性。亦可應用於藥物對基因表現的影響，以瞭解一些藥物在分子層次上的作用機制，或為臨床診斷上判斷使用劑量、復發率、治癒率及存活率的參考依歸 ^(43-46)。

五、驗證基因或部分序列之效能： 如轉染 (transfection) PTEN 基因至高度癌轉移細胞，以觀察哪些基因受到影響，是否因此導致細胞轉移能力受到抑制 ⁽⁴⁷⁾。 同時可比較有無此基因存在對下游基因表現的影響，亦為基因網路研究之一環。

六、疾病之基因型分類： 例如急性淋巴母細胞白血病 (ALL) 與急性骨髓細胞白血病 (AML)，經由基因晶片與統計分析，可定出某些基因表現的特定型態，並用於臨床上區分該兩類白血病 ⁽³³⁾。同時亦可用於疾病新亞型的發現，如非霍奇金氏淋巴瘤 (non-Hodgkin's lymphoma) 新亞型之鑑定 ⁽⁴⁸⁾。

七、致病原對細胞宿主之影響： 例如愛滋病毒 (HIV-1) 感染免疫細胞 (CD4⁺ T-cells) 後，所造成整體性基因表現改變的情形，或可作為預防愛滋病毒或其他病毒感染研究的基礎 ⁽⁴⁹⁾。

八、轉錄因子的搜尋： 在未來或許與晶片行雜交反應的不再是核酸分子，而可改換為蛋白質，則可應用於搜尋轉錄因子或其他核酸結合蛋白質 ⁽⁴²⁾。

九、遺傳網路的建構： 利用不同發育時期之老鼠胚胎，分析脊髓及海馬迴中不同基因變化趨勢，以瞭解中樞神經系統發育之各階段基因的交互作用 ⁽⁵⁰⁾，進而拼湊出中樞神經系統發育的基因網絡。

十、生物數量遺傳之研究： 例如作物產量受多基因控制，利用晶片多基因分析的能力，或許可解開數量遺傳的基因之謎，為分子育種學豎立新的里程碑。

以上所列基因晶片的應用，僅為冰山之一角，有許多的想法及應用仍需不斷繼續探索。

由於基因組計劃 (human genome project) 的即將結束，數以萬計的基因將被定序出來，而大部份的序列仍不知其功能為何。另一方面，經過部份定序的 3' 端或 5' 端序列的基因庫 (dbEST libraries) 正迅速的發展，已收集將近四百萬個已知或未知功能的生物基因 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ dbEST/ dbEST_summary.html)，並將基因做個別保存。這些基因提供一個相當方便的多基因分析資源，雖然其僅知部份序列且不完全正確，但卻可提供數以萬計的個別基因以做為基因功能研究。

如何在眾多基因間解釋其相關性，更進而描繪出基因網絡 (genetic network)，已成 21 世紀的主流。單一或少數基因的研究，實難完整解釋複雜的基因交互作用現象。而基因晶片技術卻可提供成千上萬個基因同時進行分析工作，經由自動化程序及化繁為簡的統計方式，相關的基因或一組基因就有可能被分析出來，對基因功能的研究有快速且深遠的影響。

未來，希望有更多的科學家加入這個領域，如生物、電子、機械及資訊等研究人員，積極參與開發及應用這項科技，使其能更方便且普遍地應用於各個研究領域，為功能基因這項新的研究方向共同奉獻知識與力量。除人類基因外，也期待這項科技能更廣泛應用於其他的生物體，如動物、植物等基因的研究。

在基因分析上，二十世紀若是基因組世紀 (human genome project)，這個世紀無庸置疑應為功能基因世紀 (functional genome)，這項技術也挾其強大的多基因分析能力，被喻為二十一世紀功能基因分析的主流科技之一。它提供同時大量分析基因的功能，也提供一無限想像的基因空間。藉由它，不再腸枯思竭；藉由它，基因網絡得以暢通無阻，四通八達；也藉由它，生命科學家們得以解開遺傳密碼的重重鎖鏈一窺生命的奧妙。

REFERENCES

1. Collins FS: Ahead of schedule and under budget: The Genome Project passed its fifth birthday. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10821-10823, 1995.

2. Fields C, Adams MD, White O and Venter JC: How many genes in the human genome?  Nature Genet. 7: 345-346, 1994.

3. McAdams HH and Shapiro L: Circuit simulation of genetic networks. Science 269: 650-656, 1995.

4. Nowak R: Entering the postgenome era. Science 270: 368-371, 1995.

5. Sargent TD: Isolation of differentially expressed genes. Methods Enzymol. 152: 423-432, 1987.

6. Kishimoto TK, O'Connor K, Lee A, Roberts TM and Springer TA: Cloning of the b subunit of the leukocyte adhesion proteins: homology to an extracellular matrix receptor defines a novel supergene family. Cell 48: 681-690, 1987.

7. Hogervorst F, Kuikman I, von dem Borne AE and Sonnenberg A: Cloning and sequence analysis of beta-4 cDNA: an integrin subunit that contains a unique 118 kD cytoplasmic domain. EMBO J. 9: 765-770, 1990.

8. Suzuki S, Huagn ZS and Tanihara H: Cloning of an integrin b subunit exhibiting high homology with integrin b3 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5354-5358, 1990.

9. Liang P and Pardee AB: Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971, 1992. 

10. Liang P, Averboukh L and Pardee AB: Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Nucleic Acid Res. 21: 3269-3275, 1993.

11. Heermann KH, Hagos Y and Thomssen R: Liquid-phase hybridization and capture of hepatitis B virus DNA with magnetic beads and fluorescence detection of PCR product. J. Virol. Methods. 50: 43-58, 1994.

12. DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA and Trent  JM: Use of a cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer. Nature Genet. 14: 457-460, 1996.

13. DeRisi JL, Iyer VR and Brown PO: Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 278: 680-686, 1997.

14. Schena M, Shalon D, Davis RW and Brown PO: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470, 1995.

15. Peck K, Stryer L, Glazer AN and Mathies RA: Single-molecule fluorescence detection: autocorrelation criterion and experimental realization with phycoerythrin. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 86: 4087-4091, 1989.

16. Glazer AN, Peck K and Mathies RA: A stable double-stranded DNA-ethidium homodimer complex: application to picogram fluorescence detection of DNA in agarose gels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3851-3855, 1990.

17. Velculescu VE, Z. L., Vogelstein B and Kinzler KW: Serial analysis of gene expression. Science  270: 484-487, 1995.

18. Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, Kern SE, Hruban RH, Hamilton SR, Vogelstein B and Kinzler KW: Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science 276: 1268-1272, 1997.

19. Fodor SPA: Massively parallel genomics. Science 277: 393-395, 1997.

20. Fodor SPA, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT and Solas D: Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251: 767-773,1991.

21. Fodor SPA, Rava RP, Huang XC, Pease AC, Holmes CP and Adams CL: Multiplexed biochemical assays with biological chips. Nature 364: 555-556, 1993.

22. Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H and Brown EL: Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nature Biotech. 14: 1675-1680, 1996.

23. Bernard K, Auphan N, Granjeaud S, Victorero G, Schmitt-Verhulst AM, Jordan BR and Nguyen C: Multiplex messenger assay: simultaneous, quantitative measurement of expression for many genes in the context of T cell activation. Nucleic Acids Res. 24: 1435-1443, 1996.

24. Nguyen C, Rocha D, Granjeaud S, Baldit M, Bernard K, Naquet P and Jordan BR: Differential gene expression in the murine thymus assayed by quantitative hybridization of arrayed cDNA clones. Genomics 29: 207-215, 1995.

25. Schena M, Heller RA, Theriault TP, Konrad K, Lachenmeier E, Davis RW: Microarrays: biotechnology's discovery platform for functional genomics. Trends Biotechnol. 16: 301-306, 1998.

26. Regnier FE, He B, Lin S and Busse J: Chromatography and electrophoresis on chips: critical elements of future integrated, microfluidic analytical systems for life science. Tibtech. 17: 101-106, 1999.

27. Chen JJW, Wu R, Yang PC, Huang JY, Sher YP, Han MH, Kao WC, Lee PJ, Chiu TF, Chang F, Chu YW, Wu CW and Peck K: Profiling expression patterns and isolating differentially expressed genes by cDNA microarray system with colorimetry detection. Genomics 51:313-324, 1998.

28. Bertucci F, Bernard K, Loriod B, Chang YC, Granjeaud S, Birnbaum D, Nguyen C, Peck K and Jordan BR: Sensitivity issues in DNA array-based expression measurements and performance of nylon microarrays for small samples. Hum. Mol. Genet. 8: 1715-1722, 1999.

29. Johannsson A, Ellis DH, Bates DL, Plumb AM and Stanley CJ: Enzyme amplification for immunoassays detection limit of one hundredth of an attomole. J. Immunol Methods 87: 7-11,1986.

30. Bobrow MN, Shaughnessy KJ and Litt GJ: Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. J. Immunol. Methods 137: 103-112, 1991.

31. Van Gelder RN, Von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas J D and Eberwine JH: Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1663-1667, 1990.

32. Romesburg HC: Cluster Analysis for Researchers. Krieger Publishing Company, Inc., Florida, 1990.

33. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri MA, Bloomfield CD and Lander ES: Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286: 531-537, 1999.

34. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J, Zhu Q, Kitareewan S, Dmitrovsky E, Lander ES and Golub TR: Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: methods and application to hematopoietic differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2907-2912, 1999.

35. Smith GL, Socransky SS and Sansone C:  "Reverse" DNA hybridization method for the rapid identification of subgingival microorganisms. Oral Microbiol. Immunol. 4: 141-145,1989.

36. Brunke KJ, Young EE, Buchbinder BU and Weeks DP: Coordinate regulation of the four tubulin genes of Chlamydomonas reinhardi. Nucleic Acids Res. 10: 1295-1310, 1982.

37. Chen JJW: The development and applications of gene microarray with colorimetry detection system in cancer research. Ph.D. Thesis, National Defense Medical Center, 1998.

38. Khan J, Saal LH, Bittner ML, Chen Y, Trent JM, Meltzer PS: Expression profiling in cancer using cDNA microarrays. Electrophoresis 20: 223-229, 1999.

39. Ross DT, Scherf U, Eisen MB, Perou CM, Rees C, Spellman P, Iyer V, Jeffrey SS, Van de Rijn M, Waltham M, Pergamenschikov A, Lee JC, Lashkari D, Shalon D, Myers TG, Weinstein JN, Botstein D and Brown PO: Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines. Nature Genet. 24: 227-235, 2000.

40. Iyer VR, Eisen MB, Ross DT, Schuler G, Moore T, Lee JCF, Trent JM, Staudt LM, Hudson Jr. J, Boguski MS, Lashkari D, Shalon D, Botstein D and Brown PO: The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science 283: 83-87, 1999.

41. Hacia JG: Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays. Nature Genet. 21 (1 Suppl): 42-47, 1999.

42. Kurian KM, Watson CJ and Wyllie AH: DNA chip technology. J Pathol. 187: 267-271, 1999.

43. Afshari CA, Nuwaysir EF and Barrett JC: Application of complementary DNA microarray technology to carcinogen identification, toxicology, and drug safety evaluation. Cancer Res. 59: 4759-4760, 1999.

44. Nuwaysir EF, Bittner M, Trent J, Barrett JC and Afshari CA: Microarrays and toxicology: the advent of toxicogenomics. Mol Carcinog. 24: 153-159, 1999.

45. Debouck C and Goodfellow PN: DNA microarrays in drug discovery and development. Nature Genet. 21 (1 Suppl): 48-50, 1999.

46. Scherf U, Ross DT, Waltham M, Smith LH, Lee JK, Tanabe L, Kohn KW, Reinhold W C, Myers TG, Andrews DT, Scudiero DA, Eisen MB, Sausville EA, Pommier Y, Botstein D, Brown PO and Weinstein JN: A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nature Genet. 24: 236-244, 2000.

47. Hong TM, Yang PC, Peck K, Chen JJW, Yang SC, Chen YC and Wu CW: Profiling the down stream genes of tumor suppressor PTEN in lung cancer cells by cDNA microarray. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000. (Accepted)

48. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Levy, R, Wilson W, Grever MR, Byrd JC, Botstein D, Brown PO and Staudt LM: Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403: 503-511, 2000.

49. Geiss GK, Bumgarne RE, An MC, Agy MB, van't Wout AB, Hammersmark E, Carter V S, Upchurch D, Mullins JI and Katze MG: Large-scale monitoring of host cell gene expression during HIV-1 infection using cDNA microarrays. Virology 266: 8-16, 2000.

50. Wen X, Fuhrman S, Michaels GS, Carr DB and Smith S: Large-scale temporal gene expression mapping of central nervous system development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 334-339, 1998.

51. Engler-Blum G, Meier M, Frank J and Muller GA: Reduction of background problems in nonradioactive Northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than ³²P-based hybridizations. Anal. Biochem. 210: 235-244,1993.

52. Quesada MA, Rye HS, Gingrich JC, Glazer AN and Mathies RA: High-sensitivity DNA detection with a laser-excited confocal fluorescence gel scanner. BioTechniques 10: 616-625, 1991.

53. Khrapko K, Hanekamp JS, Thilly WG, Belenkii A, Foret F and Karger BL: Constant denaturant capillary electrophoresis (CDCE): a high resolution approach to mutational analysis. Nucleic Acids Res. 22: 364-369, 1994.

54. Rye HS, Yue S, Wemmer DE, Quesada MA, Haugland RP, Mathies RA and Glazer AN: Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Res. 20: 2803-2812, 1992.

55. Skeidsvoll J and Ueland PM: Analysis of double-stranded DNA by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection using the monomeric dye SYBR green I. Anal. Biochem. 231: 359-365, 1995.

56. Viscidi RP, Connelly CJ and Yolken RH: Novel chemical method for the preparation of nucleic acids for nonisotopic hybridization. J. Clin. Microbiol. 23: 311-317, 1986.

因電腦字型關係，本文中的酵素均以『脢』字替代，nucleotide 以『核甘酸』代替。

陳健尉   台大臨床醫學研究部