NTU BioMed Bulletin

回目錄

陳 惠 文

Hypothesis 與 History

話說二十億年前，命運將細胞的祖先與細菌的祖先拉在一塊兒，而成為同甘共苦、生死與共的合夥人。她們共同面對氧壓力對生物體的毒性，並適當的將其轉化為成能量。此後，細胞展開多采多姿的演化之路，而共生的細菌則退居幕後，形成所謂的粒線體 (mitochondria)。 Mitochondria 一詞起於 1850 年，顯微鏡專家在觀察細胞內部結構時發現許多線條狀 (mitos) 和顆粒狀 (chondros) 的特異形胞器，故將其以形命名為 mitochondria。而 1912~1913 年，Kingsbury 和 Warbury 等人發現 mitochondria 為細胞的產能中心，故將其稱之為 "powerhouse of the cell"，1920~1930 年 Kerbs 發現了 citric acid cycle 及 1931 年 ATP 的發現更證明了 mitochondria 在細胞內能量的供應佔舉足輕重的地位。

Mitochondria 與 Apoptosis

一些證據指出，當初原生細菌進到細胞內的同時，不但將產能的方式帶入細胞內，以提供細胞生長、活動、分化之用；更將一些目前認為與細胞凋亡 (apoptosis) 的基因帶入細胞內，最明顯的例子是與 Bcl-2 相似的基因 CED-9 (C. elegans) 其在染色體的位置恰好在粒線體電子傳遞鏈的重要蛋白質 cytochrome b 的旁邊，這些 Bcl-2 家族的成員不論結構或功能都與一些細菌毒素相似 (如 diphtheria toxin 和 colicins)，並且 Bcl-2 家族的許多成員都會結合在粒線體的膜上，並且能在粒線體表面形成許多孔洞，而這些孔洞的形成會造成粒線體間質釋放出 cytochrome c 和 apoptosis-inducing factor (AIF) 去活化 caspases 而引起一連串細胞凋亡的現象發生。也因此粒線體被稱之為細胞凋亡的劊子手 (executioner)。

在這宛如連續劇般的情節中，調控這些粒線體內容物的釋放被認為與粒線體膜上一種稱為 mitochondrial permeability transition pore (PT pore) 的巨大通道有關，她包含了兩大部分︰一是在粒線體內膜與 adenine nucleotide translocator (ANT) 相關之蛋白質；另一是在外膜的蛋白質 (包括了 porin, voltage-dependent anion channel, VDAC)。 打開此一通道會造成粒線體內膜兩側 H⁺ gradient 消失、粒線體膜電位下降、matrix 滲透壓增高，造成粒線體漲大，外膜漲破之後  caspase-inducing factors (cytochrome c 和 AIF) 釋放到 cytosol 中造成細胞 apoptosis。在研究 PT pore 過程中發現，許多抑制 PT pore 打開的化合物可以抑制細胞 apoptosis 的發生。這些研究使得研究粒線體膜電位的改變就顯得相當重要。 因為，粒線體膜電位下降不但是細胞 apoptosis 一個重要指標；也可能是調控此一機轉相當重要的關鍵。

Mitochondrial membrane potential (Dym) 與 Mitochondrial Potential Sensor 

粒線體在呼吸氧化過程中，將所產生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜 (約 250 mV/5~10 nm)，稱之為 mitochondrial membrane potential (Dym)，並以此位能來進行電子傳遞鏈，最終產生 ATP 以供細胞使用。而此一電位差形成於粒線體內膜，為外正內負的形式。 許多親脂性的陽離子化合物會結合到粒線體內膜，在雷射激發光下放出螢光，可以非常方便地使用螢光顯微鏡或共軛焦顯微鏡來觀察粒線體的形態和移動的變化情形。最早被發現的粒線體染劑為 rhodamine 123 (Rh123)，Dr. Lan-Bo Chen 的實驗室發現 Rh123 可特異性的染在活細胞的粒線體上，而 ionophores, uncoupler 或是一些抑制電子傳遞鏈的藥物 (rotenone, antimycin, cyanide) 都會降低 Dym，並會減少粒線體攝入 Rh123 的量。之後，陸續有許多種不同的粒線體染劑被用來偵測 Dym，其中最大宗要算是 Molecule Probe 公司 (Engene, OR) 生產的一系列 MitoTracker (MitoFluor Green, MitoTracker Orange, and MitoTracker Red...etc.)，這類的染劑在細胞被固定的過程也能保存其特性；因此，常被使用於需要固定的情況並與其他像 immunocytochemistry、DAPI、或 TUNEL 來共同染色。此外，一種早期被應用於 silver-halide-based 照片的感光劑，5, 5', 6, 6' -tetrachloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) (圖一)，被發現較 Rh123 或 DiOC6 對粒線體膜電位有更高的敏感性和解析分辨能力，甚至可應用於測定單一粒線體的 Dym。 JC-1 的特性是當 Dym 小於 100 mV 時會以 monomer 的形式存在於粒線體內膜，以 488 nm 激發光下會放出 ~525 nm (FL-1H in Flow cytometry) 的綠色螢光；而當 Dym 逐漸升高，JC-1 會聚集在粒線體內膜形成橘色的 J-aggregates (~590 nm, FL-2H)；反之，當膜電位下降時，JC-1 又會形成綠色螢光的 monomer 形式 (FL-1H)。因此，JC-1 可說是一個很好的 potential-dependent 染劑，這種 potential-dependent 的色彩轉變，使得我們更容易在流式細胞儀 (flow cytometry) 或共軛焦顯微鏡來對 mitochondrial Dym 做定性與定量的分析 (圖二)。

圖一  Rhodamine 123 與 JC-1

圖二 以 JC-1 染色，使用 Flow cytometry 分析心肌細胞 (H9c2) 經過 hydrogen peroxide 造成粒線體 Dym 降低   (a) control (b) 100 mM H₂O₂

Application 與 Future

或許，並不是所有的細胞或所有與 apoptosis 相關的訊息傳遞路徑都與粒線體有關；然而，許多的證據指出粒線體的異常的確在老化過程、許多疾病的發生 (Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease)、以及細胞 apoptosis 都有相當重要的角色；此外，粒線體與自由基的生成更有密不可分的關係。因此，有了這些研究粒線體的工具可追蹤其在細胞中的移動、膜電位的改變、甚至一些與 cytoskeleton 互動的變化，將有助於解開一些粒線體無論是在生理或病理所扮演的角色。

REFERENCES

Cossarizza A, Baccarani CM, Kalashnikova G, Franceschi C (1993) A new method for the cytofluorimetric analysis of mitochondrial membrane potential using the J-aggregate forming lipophilic cation 5, 5', 6, 6'-tetrachloro-1, 1', 3, 3',-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1). Biochem. Biophys. Res. Comm. 197:40-45.

John LV, Walsh ML, Chen LB (1980) Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:990-994.

Green DR,  Reed JC (1998) Mitochondria and apoptosis. Science 281: 1309-1312.

Tsujimoto Y, Shimizu S (2000) Bcl-2 family: life-or-death switch. FEBS Let. 466: 6-10.

MitoTracker & JC-1 (1999) Molecular Probes product information (Engene, OR).

Scheffler IE (1999) Mitochondria. John Wiley & Sons, Inc., p.1-7 & p197-305.

陳惠文  台大臨床醫學部