利用電泳來進行樣本檢測，是一項重要的生化分析技術，藉由改變膠片的配置比例、使用不同緩衝液種類、甚至不同的pH值，就可適用於各種不同特性的生化樣本；另外，由電泳的原理為基礎，發展出多種解析力更好、應用範圍更廣的精密儀器。較常使用的電泳方法簡述如下：不連續膠體電泳 (disc-PAGE或native-PAGE) 一般用於檢定純度或活性分析，SDS-膠體電泳 (SDS-PAGE) 則用於蛋白質次單元體分子量的檢定。現在多以迷你平板直立式電泳，進行分析用途的電泳。
不連續膠體電泳是最基本的聚丙烯醯胺電泳形式，在分離膠體pH 8.8的電泳條件下，大部分pI小於8.8的蛋白質分子均能往正極移動，因此分子的泳動率則與樣本的電荷密度 (負電荷數/分子量) 成正比。 因膠體不含SDS，故酵素活性多能保持，可以在膠體上做酵素活性染色，也可用於大量樣本的純化，即製備式電泳。
鑄膠套件 (含電泳玻片及氧化鋁片)
間隔條 (Spacer, 0.75 mm)
樣本梳 (Comb, 10 well)
垂直電泳槽 (Hoefer SE-250平板式垂直迷你電泳槽)
電源供應器 (ISCO-453或Pharmacia Biotech EPS 200)
微量針管 (Hamilton 80465) 或電泳樣本專用吸管頭
A液 (T30%, C2.6%)：
丙烯醯胺acrylamide (Mallinckrodt
Gen AR 7717) 14.6 g
Bis (Bio-Rad
161-0201) 0.4 g
加水至50 mL，若難溶則稍微加熱助溶之，儲存於4℃。
(Bis = N,N’-Methylene-bis-acrylamide)
B液 (分離膠體緩衝液)：
Tris (Sigma
T-1503) 18.2 g
TEMED (Sigma
T-8133) 0.36 mL
用60 mL水溶解，以HCl調pH至8.8加水至100 mL，儲存於4℃。
(TEMED = N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine)
C液 (焦集膠體緩衝液)：
Tris (Sigma
T-1503) 0.6 g
TEMED (Sigma
T-8133) 40 mL
用8 mL水溶解，以HCl調pH至6.8加水至10 mL，儲存於4℃。
d. 通用電泳緩衝液 (5x)：
Tris 90
mM x 5 (Sigma
T-1503) 54.5 g
EDTA·2Na
2.5
mM x 5 (Sigma E-4884) 4.7
g
Boric
acid 80
mM x 5 (Sigma
B-0394) 24.8 g
加水800 mL溶解，以NaOH調pH至8.4後，加水至1,000 mL，室溫保存。使用前要以蒸餾水稀釋五倍。
e. APS溶液 (ammonium persulfate, 10%)：
取0.1
g溶於1 mL水，要確實溶解完全；使用前新鮮配置，過夜者不再用。
f. 追蹤染料 (tracking dye)：
取bromophenol
blue約1 mg溶於5 mL通用電泳緩衝液，加5 mL甘油混勻。
g. 高分子量標準蛋白質組合 (HMW electrophoresis calibration kit,
Pharmacia)：
Protein: 分子量 (Da)
Thyroglobulin 669,000
Ferritin 440,000
Catalase 232,000
Lactate dehydrogenase 140,000
Bovine serum albumin
67,000
◆ 注意：以native-PAGE測定的分子量，只能做為參考，不能做為唯一證據。
A. 鑄膠：
1. 將電泳玻片及氧化鋁片清洗淨後擦乾，再以玻璃清潔劑擦拭乾淨，選擇所需厚度的間隔條 (spacer) 將其組裝於鑄膠套件中。
2. 依照表2.1所列的各溶液比例，選擇所需的分離膠體濃度；配置膠體溶液時，其中APS溶液必須最後加入，小心混合均勻，以避免氣泡產生，然後緩緩倒入裝置好的鑄膠套件中。若你不知要用多少濃度的膠體，先試7.5%者。
3. 膠體高度約佔玻片的2/3至3/4高，加完後儘快在各膠體液面上方小心加入 100 mL異丙醇，以壓平膠體液面。
4. 約30 min至1 h後 (天冷須更久)，凝膠完成，倒出上層的異丙醇。
5. 配置焦集膠體溶液，先準備好所需之樣本梳 (comb)，加入溶液後立刻插入，整個過程必須在5 min完成，約30 min可完成凝膠。
6. 拆卸鑄膠套件，將多餘的凝膠去除，鑄好的膠片置於封口袋中放在4℃保存，並加入少量蒸餾水防止膠片乾裂，使用期限約為一週。
表2.1常用native-PAGE膠體溶液
(單位mL)
|
膠體溶液 |
分離膠體溶液 |
焦集膠體 |
|||||
|
5% |
7.5% |
10% |
12.5% |
15% |
20% |
4% |
|
|
A |
1.65 |
2.5 |
3.3 |
4.15 |
5.0 |
6.7 |
0.66 |
|
B |
2.5 |
- |
|||||
|
C |
- |
1.24 |
|||||
|
H2O |
5.8 |
4.95 |
4.15 |
3.3 |
2.45 |
0.75 |
3.0 |
|
APS |
0.05 |
0.1 |
|||||
|
總體積 |
10 |
5.0 |
|||||
B. 電泳：
1. 先取出膠片回溫，將稀釋成一倍的通用電泳緩衝液，倒入電泳槽的底部。接著把膠片以45度架到電泳槽上，避免氣泡產生；當電泳夾夾妥後，在電泳玻片組合的上方，加入電泳緩衝液。電泳前，先以微量針管清洗各樣本槽，避免有凝膠不完全的殘餘物留在樣本槽內。
2. 膠片一定要回復室溫後才能架到電泳槽，否則玻片會漲破。
3. 取適量的樣本 (約10~15 mL)，加入 1/4 體積之追蹤染料，混合均勻後以微量針管小心的注入膠體中的樣本槽，並避免氣泡的產生。
◆ 加入的樣本要事先定量，以便算出加入若干量的蛋白質。
4. 高分子量的標準蛋白質約需4~8 mL，作為蛋白質分子量的參考；但disc-PAGE 中，分子量的測定並不可靠，因此應避免用來決定分子量。
5. 將電泳槽上部蓋子蓋上，確認正負極裝置正確 (蛋白質由負極往正極跑)，連接上電源供應器，定電壓以100~150 V進行電泳，若膠片需做活性染色，則必須在4℃冷房中進行電泳。
6. 待追蹤染料跑出膠片後，關掉電源，取出膠片中的膠體，以解剖刀截角做記號，準備進行染色。
SDS-PAGE是在電泳系統中，利用界面活性劑SDS (sodium dodecyl sulfate) 附在蛋白質疏水區表面，由SDS本身所帶之負電荷引導泳動。 由於蛋白本身所帶電荷遠小於附著之SDS分子，因此蛋白質本身的電荷對泳動率沒有影響，泳動率只決定於蛋白質分子量，故SDS電泳適合測定蛋白質的分子量。 在樣本處理過程中，利用加熱破壞蛋白質的三級及四級結構，使其分子內部的疏水區暴露而與SDS結合；加入還原劑可破壞蛋白質分子內的雙硫鍵，常用還原劑有 b-mercaptoethanol或dithiothreitol。因此SDS-PAGE廣泛地應用於蛋白質次單元體分子量的決定。
同上節之不連續膠體電泳
除了上節所使用的藥品外，還需配置以下的藥品：
SDS膠體電泳樣本溶液 (SDS-PAGE sample
buffer, 2x)：
Tris 125
mM x 2 (Sigma T-1503) 0.3 g
EDTA·2Na 2
mM x 2 (Sigma
E-4884) 14.9 mg
SDS 2%
x 2 (Nakalai
316-07) 0.4 g
b-mercaptoethanol 5% x 2 (Sigma
M-6250) 1 mL
加二次水8 mL溶解，調pH至6.8之後，再加水至10 mL。
10% SDS溶液：
取1 g SDS溶於10 mL二次水；SDS極易揚起，注意勿吸入，以免造成傷害。
SDS電泳緩衝液 (1x)：
配置同通用電泳緩衝液，但在稀釋時加入SDS使成為0.1 % SDS。
Novex SeeBlue Pre-stained standard：
Protein:
分子量 (Da)
BSA 98,000
Glutamic dehydrogenase 64,000
Alcohol dehydrogenase 50,000
Carbonic anhydrase 36,000
Myoglobin 30,000
Lysozyme 16,000
A. 鑄膠：
方法同上節不連續膠體電泳，只是在膠體溶液中多加了1% 的SDS；膠體的濃度配方如下表2.2，10 mL約足夠鑄造兩片膠片。
表2.2常用SDS-PAGE膠體溶液
(單位 mL)
|
膠體溶液 |
分離膠體溶液 |
焦集膠體 |
|||||
|
5% |
7.5% |
10% |
12.5% |
15% |
20% |
4% |
|
|
A |
1.65 |
2.5 |
3.3 |
4.15 |
5.0 |
6.7 |
0.66 |
|
B |
2.5 |
- |
|||||
|
C |
- |
1.24 |
|||||
|
10% SDS |
0.1 |
0.05 |
|||||
|
H2O |
5.7 |
4.85 |
4.05 |
3.2 |
2.35 |
0.65 |
2.95 |
|
APS |
0.05 |
0.1 |
|||||
|
總體積 |
10 |
5.0 |
|||||
B. 電泳：
1. 取出膠片回溫，將稀釋成一倍的SDS電泳緩衝液，倒入電泳槽底部。接著把膠片以45度角放入，可避免氣泡的產生，當電泳夾夾妥後，在電泳玻片的上方，加入電泳緩衝液。同樣也要清洗每個樣本槽。
2. 取適量的樣本 (約 5~10 mL)，加入同體積之樣本緩衝液 (sample buffer) 再加入2 mL追蹤染料，混合均勻後於100℃中煮5 min，待冷卻後離心30 s，以微量針管小心注入膠體中的樣本槽，並避免氣泡產生。
3. 低分子量標準蛋白質約需4~8
mL，作為蛋白質分子量參考的依據。
4. 將電泳槽上部的蓋子蓋上，確認正負極裝置正確，連接上電源供應器，定電壓以100~150 V進行電泳。
5. 待追蹤染料跑出膠片外，關掉電源，取出膠片中的膠體，以解剖刀截角做記號，準備進行染色。
以CBR分子上的芳香苯環，與蛋白質的疏水區結合；同時其亞硫酸基團 (-SO32-)
與蛋白質的正電荷結合，可使蛋白質染出藍色色帶。是非常方便的蛋白質染色法，但其靈敏度不高，每個色帶至少要超過10 mg以上的蛋白質才染得清楚。
平台震盪器
染色缸：最好用玻璃製品，Corning廚具的長方形玻璃缸極為合用。
a. CBR染色液：
Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma B-0149) 0.75 g
用250 mL甲醇溶解後，再加入250 mL二次水及50 mL醋酸。
b. CBR脫色液：
10%醋酸與20%甲醇的水溶液。
1. 將電泳完畢的膠體浸入CBR染色液中，染色液用量只要蓋過膠片即可；置於平台震盪器上搖盪30 min。
2. 若蛋白質濃度較低，則染色時間可加長 (1 h) 以增加色帶深度。
3. 倒出染色液，用自來水沖洗後倒入脫色液，脫色液蓋過膠片即可。 於染色缸中放入一塊吸水紙，可加速脫色過程。
4. 若膠體表面有不溶的CBR染料沈積，可以用50%甲醇洗去。
利用玻璃紙 (賽路芬cellophane) 的半透膜特性，電泳膠片中的水分及甲醇在三明治組合中很容易蒸發，使膠片被壓乾且壓平於兩張玻璃紙中，可長久保存。膠片乾燥後亦可做同位素放射顯像，或者色帶濃度掃描。
玻璃板
玻璃紙
文書夾
1. 在玻璃板上鋪平第一張溼潤的玻璃紙，玻璃紙的四邊要略大於玻璃板，四邊折下，避免玻璃紙與玻璃板中有任何的氣泡產生。
2. 將染色完畢之膠片置於上述步驟之玻璃紙上。
3. 將另外一張玻璃紙浸溼，小心鋪蓋於膠片上，避免任何氣泡產生，玻璃紙的四邊要略大於玻璃板約1~2 cm，將第二層的玻璃紙四邊反摺到玻璃板背面。
4. 以文書夾夾住四角，置於室溫或37℃烘箱中乾燥。
5. 檢查膠片是否完全乾燥，可以利用指甲在膠片上輕敲，乾燥完全的膠片不會留下任何指甲痕跡；可將膠片剪下，以護貝膠膜護貝後保存。
傳統的多源性抗體為一群抗不同抗原之混合抗體。而每種抗體均由單一的脾細胞株 (B細胞) 所分泌，一個脾細胞株只產生一種抗體，此即為單株抗體。但是單獨的脾細胞無法在培養基中生長，若可分離出此細胞株並與骨髓癌細胞株融合加以培養，則得到之融合細胞可兼具分泌抗體，以及在培養基中生長的特性。本論文以NS-1細胞株與經抗原免疫balb/c小白鼠脾細胞進行融合，期以單株抗體之專一性，避免分析citrinin時受到構型類似之小分子干擾。
因為本實驗之抗原citrinin為分子量僅250 Da之小分子，將其預先鍵結在大分子蛋白質KLH分子上，再打入動物體內可以有較好之免疫效果。
37℃恆溫箱 (Memmert)
Hemocyanin (Sigma, H-7017)
甲醛 (Merck)
Citrinin (Sigma, C-1017)
透析膜 (Seamless cellulose tubing
36/32, 分劃分子量12,000~14,000 Da)
醋酸鈉反應液
natriumacetate 0.1 M
(Riedel-deHaen)
0.82 g
溶於80 mL水中，以HCl調pH至4.2，加水定體積至100 mL。
1. 取0.6 mg之KLH溶於80 mL之0.1 M醋酸鈉反應液中，並與15 mL之10 mg/mL citrinin相混合。
2. 迅速加入40 mL之甲醛溶液，均勻混合後，置入37℃培養箱中反應24 h。
3. 反應完成之後，會出現大量黃色沈澱物，以0.01 M之PBS進行透析24 h。
4. 置換透析液，如此反覆透析三次為止。
將所欲得到之抗原加入佐劑 (adjuvant) 製成乳劑之後，注射入動物體內，使其誘發免疫反應而產生所需的抗體。使用BALB/c小白鼠進行免疫注射；誘生腹水使用小鼠之骨髓癌細胞NS-1，解凍後經培養穩定方可使用。免疫程序及細胞培養技術主要參考莊榮輝博士論文
(1985) 及吳其真碩士論文 (1998)。
BALB/c小白鼠 (購自台大醫學院實驗動物中心)
三向轉接頭 (Nipro)
Prafilm (American National Can)
注射器針頭 (1 mL, Terumo)
50 mL離心管
抗原溶液 (KLH-formaldehyde-citrinin)
PBS (Phosphate buffer saline, 10×)：
NaCl (0.13 M × 5) (Merck
6404) 75.97 g
NaH2PO4 (0.01 M × 5) (Wako
192-02815) 15.60 g
加水800 mL溶解後，用NaOH調成pH 7.2，再定量至1,000 mL，成為10倍的PBS。使用前稀釋10倍。
Reaserch Adjuvat TiterMax Gold
Pristane (2,6,10,14-tetramethyl-pentadecane) (Sigma
T- 7640)
骨髓癌細胞 (NS-1細胞株)
1. 購買四週大balb/c小白鼠，待飼養至六週大時，開始進行抗體誘導。每隻小鼠每次免疫使用200 mg抗原。
2. 取出已分裝好的抗原置入注射器內，另一支注射器則吸入約0.3 mL PBS。
3. 將三向轉頭接上注射器，並以parafilm將注射器與三向轉接頭之連接處包裹好，防止反覆吸放壓力過大而噴出。
4. 反覆的吸放注射器，使其充份均質。
5. 將均質之抗原集中至一支注射器，小心地拆開三項轉頭。
6. 另取與均質化抗原相等體積的TiterMax吸入另一支新的注射器內，再吸入抗原。小心擠出注射器內的氣泡。
7. 反覆的吸放注射器，使其充份乳化。可將乳化後的樣品滴於水面上測試，若乳化後的樣品不溶於水，表示完全乳化。
8. 乳化完全之抗原對小白鼠進行腹腔注射。
9. 每隔兩週注射一次，共進行八次。
10. 隔週注射不加佐劑之抗原，3~5 d後進行細胞融合。
本實驗使用PEG (polyethyene glycol) 作為細胞融合劑，對骨髓癌細胞NS-1與小白鼠脾臟細胞進行融合。
二氧化碳培養箱 (Forma, Model 3158) 及CO2鋼瓶 (37℃, 7% CO2)
37℃水浴
倒立式位相差顯微鏡 (Nikon Diaphot)
血球計數器 (AO, USA)
水平氣流無菌操作箱 (台灣海天牌，14HT-24型)
離心機 (International Centrifuge, Universal Model UV)
高壓滅菌釜
無菌離心管 (15 mL, 50 mL)
96孔、24孔細胞培養盤及T-25, T-80培養瓶 (Nunc)
解剖用手術剪刀、尖頭攝子、鈍頭攝子、止血鉗及大頭針十數支
酒精燈
無菌玻璃吸管
小型培養皿四個
鋁箔紙及普力龍板
計時器
a. RPMI 1640培養基 (Seromed FG 1285)：
內含5.5 g/L NgCl, 25 mM HEPES, 2.0 g/L NaHCO3, 5 mg/L Phenol
Red及0.532 g/L N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamine。貯存於4℃備用，可保存半年以上。
b. Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone SH 30070.03)：
L-Glutamine
(Flow 15-801-05)
取584 mg溶於20 mL純水，使用時稀釋100倍。於4℃儲存。
c. Pen-Strep (penicillin-stretomycin, Flow
16-700-49)：
5000
IU/mL-5000 mg /mL，使用時稀釋100倍。於4℃儲存。
d. Sodium pyruvate (Flow 16-820-49, 100 mM, 100x)：
使用時稀釋100倍。置於4℃保存。
◆ 以上藥品均先以無菌濾膜過濾後使用。
e. RPMIX培養基：
RPMI 1640 (Seromed
FG1285) 170 mL
FBS (Hyclone
SH30070.03) 30 mL
L-Glutamine (Flow
15-801-05) 2 mL
Sodium pyruvate (Flow
16-820-49) 2 mL
Pen-Strep (Flow
16-700-49) 2 mL
上述溶液混合後使用。置於4℃保存。
f. Polyethyene glycol 1500 (PEG) (BM 7836641, 50%,
w/v)
g. HT (Flow 16-808-49, 50x)：
含hypoxanthine 68 mg/100 mL, thymidine 19.4 mg/100 mL，儲藏於-20℃。使用前以無菌濾膜過濾之。
h. HT-RPMIX培養液：
取2 mL HAT與RPMIX 98 mL均勻混合。
i. HAT (Flow 16-808-48, 50X)：
含hypoxanthine 68 mg/100 mL, thymidine 19.4 mg/100 mL, 另加aminopterin 0.88 mg)，儲藏於-20℃。使用前以無菌濾膜過濾之。
j. HAT-RPMIX培養液：
取2 mL HAT與 RPMIX 98 mL均勻混合。
◆ HAT與HT溶解度均不佳，使用時須注意混合均勻，aminopterin應避光貯存。
1. 進行細胞融合前需先準備好各種議器設備和藥品，以及已經免疫好的小白鼠。而融合進行的時機則取決於骨髓癌細胞NS-1的生長情形。
2. NS-1細胞：一次融合約需一個T-80培養瓶的NS-1細胞，融合前1 d換新 1/3~1/2培養液，一般而言細胞密度不應超過80×104個/mL。最有效的方法是直接用顯微鏡觀察，健康的細胞應呈圓形而發亮。不要讓細胞長滿T-80的底部。NS-1的健康可能比NS-1的數目，對融合結果的影響要大。
A. 脾細胞收集：
1. 解剖工具清洗乾淨，以高壓滅菌後，以80℃烘乾。
2. 另準備一小燒杯內中100 %酒精浸泡使用過解剖工具。
3. 在無菌操作箱中將器具佈置好，將保麗龍以鋁箔包好，噴上75%酒精。
4. 小鼠以乙醚昏迷至死。在鋁箔上以酒精噴灑全身，再以衛生紙擦拭。
5. 將小鼠以大頭針固定在包好鋁箔的保麗龍板上，使其左腹凸出向上。
6. 雙手消毒後開始進行解剖。
7. 先以鑷子鑷起表皮，以尖頭剪刀剪開表皮，先橫剪向背部至約腎臟，再直剪開，打開成三角形，注意勿傷及真皮。
8. 透過真皮，判定脾臟位置，左手以尖頭鑷子挑起脾臟附近之真皮，右手以眼科剪刀小心剪開一小洞口，再向背部剪去，鑷子仍得挑起真皮，勿落下，剪開後撥開真皮。
9. 換一套鈍頭鑷子及眼科剪刀，以鑷子夾起脾臟，用剪刀剪開下面黏著之結締組織，取出脾臟。
10. 先浸入一個裝有RPMI 1640的培養皿中，以鈍頭剪刀剪去白色的結締組織，再換到另一個裝有10 mL
RPMI 1640的培養皿清洗脾臟。
11. 同樣再二次以含有10 mL RPMI 1640的培養皿清洗脾臟。
12. 在第三個培養皿中的夾住脾臟，以10 mL針頭密密麻麻地在脾臟穿刺。再以針頭吸取培養皿中的RPMI 1640，用力注入脾臟內，細胞便會由小孔紛紛流出。
13. 徹底沖出脾細胞內細胞，以玻璃吸管吸取細胞液，裝入15 mL離心管，組織碎片會沈降至管底。
14. 吸出上清液至50 mL離心管中，以PRMI 1640洗二次，加RPMI 1640至33 mL 左右，900 rpm離心10 min。
15. 小心倒去上清液，再加入RPMI 1640約5 mL，先拍打散細胞，使之懸浮，再加RPMI 1640至33 mL左右，離心900 rpm 10 min。
16. 重覆上述步驟。共以RPMIX洗三次。
17. 每個脾臟細胞約有108個細胞，以此來進行細胞融合。
18. 取完脾臟，可在腹腔內剪斷血管或將心臟剪開，收集流出血液，以測抗體效價。
B. 細胞融合法：
1. 以培養液沖下NS-1細胞 (T-80約八分滿)。850
rpm離心5 min，去上清。先加少量新鮮的RPMI 1640，使細胞懸浮，再加至10 mL。
2. 上以述方式，RPMI
1640洗三次。
3. 融合在50 mL離心管中進行。將洗淨之NS-1細胞與以取出的脾細胞混合，加PRMI 1640至33 mL左右，900 rpm離心10 min後，去上清。
4. 利用管壁殘留之培養液，將細胞均勻打散。
5. 準備計時器，開始進行融合。將裝有細胞之離心管放在一裝有37℃純水的燒杯內，一邊搖動一邊緩慢加入0.7 mL PEG 1500，慢慢在1 min內加完，混合均勻。
6. 再均勻搖晃1 min。
7. 緩緩地於2 min內滴完2 mL PRMI 1640，邊加邊搖晃均勻，漸漸稀釋掉PEG。
8. 同上法，再於2 min內滴完8 mL PRM 1640。
9. 以850 rpm離心8 min去上清 (需將含有PEG之上清倒乾淨，因PEG與細胞接觸時間太長，對細胞有害)。
10. 加入30 mL HAT-RPMIX輕輕混合，使細胞懸浮，勿以吸管用力吸放。
11. 離心管連同細胞，置於37℃ CO2恆溫培養箱中1~2 h。
12. 均勻混合後，將細胞均分成三至四盤96槽培養盤中，以滴管分注入槽中，每槽約2~3滴。注意離心管內的懸浮液要不時均勻混合。且分注細胞時，勿使滴管碰觸培養盤四周。
C. HAT篩選：
1. 融合完成後 (D0)
即加入HAT。
2. 融合後第三天 (D2)
可看到有二元體及三元體的細胞出現。加入兩滴 HT-PRMIX於各槽中。此後每隔兩天加一次培養液。
3. 第五天 (D4)
後NS-1逐漸死去，可以看見細胞聚成的群落，為融合成功的細胞。小心吸出0.1 mL培養液，加入0.1 mL新鮮HT-RPMIX。
4. 七天後可以肉眼看到白點狀的細胞群落，將各槽加至七分滿，以利取樣。約第十天可以開用ELISA篩選，以後每隔3~5 d可取樣一次。
5. 約在融合後二到三週後，細胞生長可趨於穩定。
D. 單株化：
1. 以限數稀釋法
(limiting dilution) 進行。先數好原細胞培養皿中的細胞密度，加RPMI 1640至10 mL，使細胞濃度稀釋為每mL含104個。
2. 以RPMI 1640進行系列稀釋，使得最後細胞濃度為每mL含20個。
3. 於96槽培養盤A~D列中每槽加入100 mL，即每槽中含有2個細胞。
4. 再以RPMIX稀釋一倍，於E~H列中加入100 mL，即每槽中含有1個細胞。
5. 將培養盤置入恆溫箱中培養。
6. 隔天，以顯微鏡觀察每個槽，將僅含有一個細胞的培養槽做上記號；而含有兩個以上也記號放棄。
7. 每2~3 d添加一次新鮮的RPMIX，觀察單個細胞群落的生成。待細胞群落長大，即可對培養液進行ELISA分析，找出含正反應之群落。
8. 確定為單一群落，且又有抗體產生，則盡快擴大至24槽培養，再擴大至T-25 中培養；並盡快做細胞冷凍以維持細胞株之延續。
獲得細胞株或融合瘤株之後，應儘速冷凍保存。
細胞可用dimethy sulfoxide (DMSO) 或甘油長期保存在液態氮中，雖可保存在 -70℃，但僅能保存數週。
-70℃冷凍箱
液態氮及鋼瓶
冷凍小瓶 (cryotube)
DMSO保存液：
DMSO (dimethyl sulfoxide) (Merck 9678) 1.0
mL
RPMIX 3.0
mL
FBS 4.0
mL
於冰浴下將DMSO慢慢滴入RPMIX，邊加邊搖，然後再加入FCS。應新鮮配製。
1. 欲冷凍的細胞密度大約每mL 含5×105個，操作前一天應換1/2~1/3培養基。
2. 以玻璃吸管沖下細胞，計算細胞數目，離心850 rpm去上清液，利用餘液將細胞沈澱打碎散。
3. 冰浴下，慢慢滴入DMSO保存液，使成均勻懸浮液，每5×106個細胞加1 mL DMSO保存液。
4. 每1 mL懸浮液裝入一支冷凍小瓶中，封口至於碎冰上。
5. 將冷凍小瓶插入普力龍架內，置於-70℃隔夜。
6. 戴粗布手套迅速取出冷凍小瓶，放入液態氮中保存。
37℃水浴
定時器
RPMI 1640
RPMIX
1. 戴上布手套，於液態氮中取出冷凍小瓶，立即在37℃水浴中搖晃解凍，此步驟於1 min完成。
2. 外表以75%酒精擦拭，小心打開瓶口。
3. 一滴一滴加入1 mL
RPMI 1640，搖晃混合1 min。
4. 移入15 mL離心管中，緩慢加入8 mL RPMI 1640搖晃混合，於5 min內完成。
5. 850 rpm離心5 min，去掉上清液。
6. 先加入2 mL RPMIX，將細胞輕拍懸浮後，再加入8 mL RPMIX。
7. 倒入T-25中培養。
8. 隔日，輕搖一下T-25，倒去懸浮細胞碎片及培養液，再加入新鮮10 mL RPMIX。
單源抗體可以利用兩種方法來生產：(1) 大量培養細胞，純化培養液中的抗體； (2) 將細胞株注射到小白鼠體內，誘導產生腹水。
(1) 培養液生產法：
視需要利用不同的細胞培養瓶來培養細胞，例如以T-25, T-80, T-125來生產，可以收5 mL至100 mL不等。此法所得抗體以Protein A-Sepharose CL-4B 純化最為有利。
(2) 腹水生產法：
1. 取八週以上BALB/c小白鼠數隻，每隻腹腔注射0.5 mL pristane。
2. 7~10
d後，取融合細胞，離心去上清後，懸濁於0.5 mL RPMI 1640中，打入小白鼠腹控。每隻小白鼠需用106~107個細胞，約為一個T-25。
3. 一到二週後，小白鼠腹部脹大，取19號塑膠針頭，剪去塑膠接頭，插入小白鼠腹腔，以離心管收集滴出之腹水，離心去除細胞後，最好立即進行免疫球蛋白純化。
腹水需純化而以得免疫球蛋白 (IgG)。利用0-40%硫酸銨飽和濃度可將免疫球蛋白沈澱下來，為初步的純化步驟；也可進一步以膠體過濾法或離子交換法進行 IgG之純化。
高速冷凍離心機 (Hitachi 20PR-52 或 CR-22)
透析膜 (Seamless cellulose tubing 36/32, 分劃分子量12,000~14,000 Da)
硫酸銨 (ammonium sulfate, Merck 101211)：
藥品於烘乾後直接使用。
PBS
(phosphate buffer saline, 1x)：
配方同前所述。
1. 得到小白鼠之腹水，於4℃下靜置30~60 min。
2. 以1,500 rpm離心20 min去除細胞及血球碎裂物 (lysate)。
3. 加入2倍體積的PBS (1x) 混合均勻，於冰浴下進行0-40%飽和度的硫酸銨沈澱，平衡30 min，準備離心回收IgG沈澱。
4. 以15,000 rpm離心30 min，去除上清。
5. 沈澱回溶於與腹水同體積之PBS，並對4 L PBS進行透析隔夜。
6. 透析後的樣品，再以15,000 rpm離心20 min，取上清液。
7. 加入等體積的甘油保存於-20℃，此即為純化之免疫球蛋白。
8. 接著進行ELISA測試抗體之效價。
酵素免疫分析法 (enzyme immunoassay, EIA) 或稱為酵素連結免疫吸著劑分析法 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) ，均在96槽微量滴盤 (96-well microtiration plate，簡稱ELISA盤) 中操作，可直接以專用的ELISA光度計 (ELISA reader) 測得每一樣品的呈色吸光，非常方便且快速。為了操作方便起見，我們一律將已知的抗原固定在固相上，以間接標示法 (indirect labeling，簡稱間接法) 來測定未知抗體量。下圖說明間接標示法的反應過程。
37℃恆溫箱 (Memmert)
ELISA光度計 (Dynatech
Laboratories MRX)
ELISA 96槽微量滴定盤 (Nunc
442404)
八管自動吸管 (Biohit 250)
明膠-NET (NaCl-EDTA-Tween)：
Gelatin (0.25%) (Merck
4078) 5 g
NaCl (0.15 M) (Merck
6404) 17.5 g
EDTA.2Na (5 mM) (Merck
8418) 3.6 g
Tween 20 (0.05%) (Merck
822184) 1 mL
Tris (hydroxymethyl) methylamine (50 mM) (BDH 103157P) 12.1 g
加熱至gelatin溶解，待冷卻至室溫後，調pH至8.0，再定量至2 L。
PBS (phosphate buffer saline, 10×)：
NaCl (0.13 M × 5) (Merck
6404) 75.9 g
NaH2PO4 (0.01 M × 5) (Wako
192-02815) 15.6 g
加水800 mL溶解後，用NaOH調成pH 7.0，再定量至1 L，成為10倍的PBS。使用前稀釋10倍。
PBST (phosphate buffer saline & Tween-20)：
將10倍的PBS稀釋至1倍，並加入0.05% (v/v) Tween-20。
二次抗體 (Horse radish perxidase-goat-anti-mouse, HRP-GAM)：
perxidase-conjugated goat IgG fraction to
mouse immunoglobulins (IgG, IgM, IgA) (Cappel 55556)
使用前以PBS (1×) 稀釋1,000~1,500倍。
◆ 原液須儲存於-20℃，使用前新鮮配製。
OPD基質液：
o-Phenylenediamine (Sigma
P-1526) 40
mg
H2O2 (Merck
7210, 30﹪) 10
mL
以PBS (1x) 溶解後，定量至100 mL。
◆ 使用前新鮮配製、以深色瓶避光下保存，隔夜不可再使用。
◆ OPD粉末事先分裝成小瓶，以免因反覆冰凍、解凍而變質。另外OPD可能為致癌物質，注意勿吸入塵埃或直接接觸。
1. Carrier protein吸附反應 (Coating)： 取BSA以PBS
(1x) 稀釋濃度2 mg/mL，在ELISA盤中每槽加入0.1 mL，以透明膠布將整個滴定盤蓋上，防止溶液蒸發。於37℃下反應2 h，或可直接4℃過夜。
2. 抗原與carrier
protein鍵結 (Conjugation)：吸附反應後吸去carrier
protein，以PBST洗三次。取20 mL citrinin加入50 mL之醋酸鈉溶液中，並同時加入30 mL 之甲醛，充分混合之後，全數加入ELISA盤中，於37℃下反應12 h。
3. 填塞 (Blocking)：
吸附反應後吸去抗原，以PBST洗三次。每槽加入NET液0.2 mL，膠帶封口後，置室溫反應1~2 h後洗去，再以PBST洗過三次。可置於4℃備用。
4. 抗原抗體反應： 抗體溶液以NET稀釋至適當濃度，每槽加入0.1 mL，以膠帶封口，於37℃下反應30 min後，再於4℃反應1 h。反應後吸去抗原，以PBST洗三次。
5. 二次抗體反應： 二次抗體以PBS稀釋至適當倍數後，每槽加入0.1 mL，以膠帶封口後，於37℃下反應30 min後，4℃反應1 h。注意需非常小心的加入二次抗體溶液，避免溶液超出NET填塞的範圍而影響呈色。反應後，小心吸去酵素連結體溶液，以PBST洗五至七次。
6. 酵素呈色反應： 每槽加入0.15 mL OPD基質液呈色，最好以八管自動吸管快速添加完成，避光於室溫下反應。若室溫太低，可置於37℃內加速反應。呈色約在半小時後趨於穩定。使用ELISA光度計測405 nm波長吸光值。
蛋白質經電泳之後，由電泳轉印法將蛋白質轉印至PVDF轉印膜，先利用專一性抗體 (一次抗體)，對抗原進行辨識，再以二次抗體對一次抗體作專一性的辨識結合。二次抗體上連結有特定的呈色酵素 (horse radish peroxidase, HRP或alkaline
phosphatase, AP)，可以經由酵素反應而呈色。此步驟可以提高抗體的專一性，染色的靈敏度也大幅的提升。
平台震盪器 (TKB OS701)
明膠-NET (NaCl-EDTA-Tween)：
Gelatin (0.25%,
Merck 4078) 5 g
NaCl (0.15
M, Merck 6404) 17.5 g
EDTA·2Na (5
mM, Merck 8418) 3.6 g
Tween 20 (0.05%,
Merck 822184) 1 mL
Tris (50
mM, BDH 103157P) 12.1 g
先以少量二次水將gelatin加熱溶解，然後加二次水及其他試劑至1,700 mL，調pH至8.0，再定量至2,000 mL。
PBS (Phosphate buffer saline, 10×)：
NaCl (0.13
M×5, Merck 6404) 75.9 g
NaH2PO4 (0.01
M×5, Wako 192-02815) 15.6 g
加水800 mL溶解後，用NaOH調成pH 7.0，再定量至1,000 mL，成為10倍的PBS。使用前稀釋10倍。
PBST (Phosphate buffer saline & Tween-20)：
將10倍的PBS稀釋至1倍，並加入0.05% (v/v) Tween-20，即為PBST。
(1) HRP呈色系統：
二次抗體 (Horse radish peroxidase-goat anti mouse, HRP-GAM)：
Peroxidase-conjugated goat IgG fraction to mouse
immunoglobulins (IgG, IgM, IgA) (Cappel 5556)
使用前以NET稀釋1,000~1,500倍。
◆ 原液須儲存於4℃或加甘油至50%於 -20℃儲存，使用前新鮮配製。
DAB呈色液：
Diaminobenzidine (Sigma
D-5637) 5 mg
H2O 2 (30%) (Merck 7210) 10 mL
以PBS (1×) 溶解後，定量至100 mL。
◆ 使用前新鮮配置、以深色瓶避光下保存，隔夜不可再使用。
◆ DAB粉末事先分裝成小瓶，以免因反覆冰凍、解凍而變質。 另外DAB可能為致癌物質，注意勿吸入塵埃或直接接觸。
(2) AP呈色系統：
二次抗體
：
Biotin-conjugated goat IgG fraction to mouse
immunoglobulins (IgG, IgM, IgA) (Cappel 5556)
使用前以NET稀釋1,000~1,500倍。
◆ 原液須儲存於4℃或加甘油至50%於 -20℃儲存，使用前新鮮配製。
AP緩衝液 (alkaline phosphatase buffer)：
MgCl2 (0.5
mM × 1, Sigma M-8266) 47.6 mg
將MgCl2加入800 mL之PBS (2X) 中，以NaOH調pH至9.5，再定量至1 L。
A + B試劑：
A reagent (Vectastain,
avidin)
B reagent (Vectastain,
biotinylated alkaline phosphatase)
以明膠-NET稀釋1,500倍並混合均勻，室溫下反應30 min後使用。
NBT試劑：
Nitro blue tetrazolium (Sigma,
N-6876) 0.5
g
溶於10 mL的70% dimethylforamide (DMF, Merck 3053)。
BCIP試劑：
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (Sigma,
B-6149) 15
mg
溶於0.3 mL的H2O，使用前新鮮配製。
AP呈色劑：
BCIP試劑 33
mL
NBT試劑 66
mL
呈色前溶於10 mL 1×
AP緩衝液中。
(1)
HRP呈色系統：
1. 將Urea-PBST洗過的轉印膜再以PBST洗三次，每次10 min。
2. 加入適量的明膠-NET，反應30 min。
3. 加入以明膠-NET稀釋至適當倍數的一次抗體，室溫下反應1 h。
4. 以PBST洗三次，每次10 min。
5. 加入以明膠-NET稀釋至適當倍數的二次抗體 (HRP-GAM 2nd-Ab)，室溫下反應1 h。
6. 以PBST洗3次，每次10 min。
7. 加入DAB，可在5~30 min呈色。 若天冷可置於37℃烘箱增快反應；在背景顏色尚未變深前，倒去呈色劑，以蒸餾水清洗數次。
8. 免疫呈色結果的好壞，取決於每次清洗步驟是否完全、徹底；過於隨便的清洗步驟會造成染色結果不良。
(2) AP呈色系統：
1. 起始步驟與HRP系統相同，為所加之二次抗體為biotinylated 2nd-Ab (anti-mouse)，室溫下反應1 h。
2. 以PBST洗3次，每次10 min。
3. 加入預先混合30 min之A+B試劑，反應1 h。
a. 以PBST洗2次，每次10 min。
b. 以AP緩衝液 (1×) 洗2次，每次10 min。
c. 加入呈色劑呈色，可在5~30
min內得到紫黑色色帶，若天冷可置於37℃烘箱增快反應；在背景顏色尚未變深前，倒去呈色劑，以蒸餾水清洗數次。
將呈色完全的PVDF膠膜，浸入100%甲醇1 min，如此可避免呈色基質未洗淨而造成染好的PVDF背景顏色加深。
競爭型酵素免疫分析法 (competitive enzyme immunoassay)，利用固定量之一次抗體與樣本中之抗原結合，未被樣本結合之剩餘一次抗體，則可與固相上的抗原結合，再利用二次抗體定量後者，得以反推樣本中的抗原量。本實驗採用競爭型間接分析法 (competitive direct EIA)，以下為本實驗之流程。
37℃恆溫箱 (Memmert)
ELISA光度計 (Dynatech
Laboratories MRX)
ELISA 96槽微量滴定盤 (Nunc
442404)
八管自動吸管 (Biohit 250)
Carrier protein：
Albumin (2
mg/mL, Sigma A-4503) 20 mg
以10 mL之PBS溶解。
抗原溶液：
Citrinin
(10 mg/mL, Sigma C-1017) 25 mg
以2.5 mL甲醇溶解。
醋酸鈉反應液：
Na acetate 0.1 M (Riedel-de Haen)
0.82 g
溶於80 mL水中，以HCl調pH至4.2，加水定體積至100 mL。
明膠-NET (NaCl-EDTA-Tween)：
Gelatin (0.25%,
Merck 4078) 5 g
NaCl (0.15
M, Merck 6404) 17.5 g
EDTA·2Na (5
mM, Merck 8418) 3.6 g
Tween 20 (0.05%,
Merck 822184) 1 mL
Tris (50
mM, BDH 103157P) 12.1 g
先以少量二次水將gelatin加熱溶解，然後加二次水及其他試劑至1,700 mL，調pH至8.0，再定量至2,000 mL。
PBS (phosphate buffer saline, 10×)：
NaCl (0.13
M×5, Merck 6404) 75.9 g
NaH2PO4 (0.01
M×5, Wako 192-02815) 15.6 g
加水800 mL溶解後，用NaOH調成pH 7.0，再定量至1,000 mL，成為10倍的PBS。使用前稀釋10倍。
PBST (Phosphate buffer saline & Tween-20)：
將10倍的PBS稀釋至1倍，並加入0.05% (v/v) Tween-20，即為PBST。
(1) HRP呈色系統：
二次抗體
：
Peroxidase-conjugated goat IgG fraction to mouse
immunoglobulins (IgG, IgM, IgA) (Cappel 55556)
使用前以PBS稀釋1,000~1,500倍。
◆ 原液須儲存於4℃或加甘油至50%於 -20℃儲存，使用前新鮮配製。
A + B試劑：
A reagent (Vectastain,
avidin)
B reagent (Vectastain,
biotinylated peroxidase)
以明膠-NET稀釋100倍並混合均勻，室溫下反應30 min後使用。
OPD基質液：
o-Phenylenediamine (Sigma
P-1526) 40
mg
H2O2 (Merck
7210, 30%) 10
mL
以PBS (1x) 溶解後，定量至100 mL。
◆ 使用前新鮮配製、以深色瓶避光下保存，隔夜不可再使用。
◆ OPD粉末事先分裝成小瓶，以免因反覆冰凍、解凍而變質。另外OPD可能為致癌物質，注意勿吸入塵埃或直接接觸。
(2) AP呈色系統：
二次抗體
：
Peroxidase-conjugated goat IgG fraction to mouse
immunoglobulins (IgG, IgM, IgA) (Cappel 55556)
使用前以PBS稀釋 1,000~1,500倍。
◆ 原液須儲存於4℃或加甘油至50%於 -20℃儲存，使用前新鮮配製。
AP緩衝液 (Alkaline phosphatase buffer)：
MgCl2 (0.5
mM × 1, Sigma M-8266) 47.6 mg
將MgCl2加入800 mL之PBS (2×) 中，以NaOH調pH至9.5，再定量至1 L。
A + B試劑：
A reagent (Vectastain,
avidin)
B reagent (Vectastain,
biotinylated alkaline phosphatase)
以PBS稀釋100倍並混合均勻，室溫下反應30 min後使用。
pNPP呈色液：
p-Nitrophenyl
phosphate (Pierce,
34045) 0.01
g
溶於10 mL AP緩衝液，待其溶解，加入10 mL diethanolamine。
1. Carrier protein吸附反應 (Coating)： 取BSA以PBS
(1×) 稀釋濃度至2 mg/mL，在ELISA盤中每槽加入0.1 mL，以透明膠布將整個滴定盤蓋上，防止溶液蒸發。於37℃下反應2 h，或可直接4℃過夜。
2. 抗原與carrier
protein鍵結 (Conjugation)：吸附反應後吸去carrier
protein，以PBST洗三次。取20 mL citrinin加入50 mL之醋酸鈉溶液中，並加入30 mL之甲醛，充分混合之後，全數加入ELISA盤中，於37℃下反應18 h。
3. 填塞 (Blocking)：鍵結反應後吸去抗原反應液，PBST洗三次。每槽加入NET 液0.2 mL，膠帶封口後，置室溫反應1~2 h後洗去，再以PBST洗過三次。可置於4℃備用。
4. 抗原抗體反應： 抗體溶液以NET稀釋至適當濃度，每槽加入0.05 mL，並迅速加入0.05 mL之樣本，充分混合後以膠帶封口，於37℃下反應1 h。接著再於4℃反應30 min。反應後吸去抗原，以PBST洗三次。
5. 二次抗體反應： 二次抗體以PBS稀釋至適當倍數後，每槽加入0.1 mL，以膠帶封口後，於37℃下反應1 h後，4℃反應30 min。注意需非常小心的加入二次抗體溶液，避免溶液超出NET填塞的範圍而影響呈色。反應後，小心吸去酵素連結體溶液，以PBST洗五至七次。
6. 加入預先混合30 min之A+B試劑，反應1 h。
7. AP呈色反應：吸去A+B試劑，以PBST洗3次。每槽加入0.15 mL pNPP基質液呈色，最好以八管自動吸管快速添加完成，避光於室溫下反應。若室溫太低，可置於37℃內加速反應。呈色約在半小時後趨於穩定。使用ELISA光度計測405 nm波長吸光值。
8. 若用HRP呈色系統進行實驗，則以OPD基質液呈色。
實驗室中培養紅麴一般都分為固態米麴培養與液態培養基培養兩種。本實驗分別以固態及液態培養基培養紅麴菌到成品階段，並以ELISA系統追蹤偵測其不同天數培養下，citrinin生成量之變化，並近一步驗算其回收率。
30℃恆溫培養箱 (Hotech)
滅菌釜 (Tomin)
麴盤 (長×寬×高 = 20×30×5 cm)
麴布
在來米
無菌水
以滅菌釜高溫溼熱滅菌20 min
紅麴菌種 (Monascus purpureus CCRC 31615由台大農化系農產利用研究室潘子明教授提供)
1. 滅菌：將在來米500 g以水洗淨，浸泡6 h，以麴布濾水後，置於麴盤上，在滅菌釜中以高溫溼熱滅菌法殺菌20 min後，待其冷卻加入實驗組溶液 (對照組則以灑水代替)，再次以滅菌釜高溫溼熱滅菌20 min。
2. 接種麴菌 (第○天)：將種菌接入蒸熟的米中，均勻翻攪後，集中在麴盤中央，以蒸布紮緊，置於30℃恆溫箱中培養24 h。
3. 翻攪麴米 (第一天)：因菌體生長快速，為防止品溫升高太快，予以翻攪，並將米粒均勻鋪平在麴盤上。
4. 施灑頭水 (第二天)：此時米粒中之水分已因溫度上升而被消耗大半，需要增加水分以維持正常生長。將麴盤中的米粒集中在中央，並以麴布紮緊取出，浸入無菌水中30 min，之後再濾水30 min。把米粒攤平在麴盤中央，置入30℃中培養24 h。
5. 施灑次水 (第三天)：再次施水，將麴盤中的米粒集中在中央，以麴布紮緊取出，浸入無菌水中20 s，再將水濾乾。把米粒攤平在麴盤中央，繼續置入30℃中培養24 h。
6. 最後施水 (第四天)：最後一次施水，以灑水之方式，早晚各灑水約50 mL。
7. 培養成熟 (第五至十天)：每10 h予以翻攪，俾使繁殖面積達到最大。
8. 麴米乾燥：待米麴乾燥後即為成品。
30℃恆溫培養箱 (Hotech)
滅菌釜 (Tomin)
培養瓶
無菌水
以滅菌釜高溫溼熱滅菌20 min
紅麴菌種 (Monascus purpureus CCRC 31615由台大農化系農產利用研究室潘子明教授提供)
液態培養基
Glucose (Nacalai
tesque 168-05) 20 g
Monosodium glutamate (MSG) (味王味精) 5 g
K2HPO4 (Wako
167-04305) 5 g
KH2PO4 (Wako
16-424) 5 g
CaCl2 (Sigma
c1016) 0.1 g
MgSO4．7H2O (Wako
138-00415) 0.5 g
FeSO4．7H2O (Sigma
F700) 0.01 g
以800 mL之無菌水溶解，並調整pH至6.5，後定量至1 L。
1. 將菌數108之種菌接入100 mL液態培養基中，以1 L之培養瓶進行培養。
2. 培養瓶放入30℃之培養箱中，以125 rpm之速度進行培養約一週收成。
50℃水浴槽
0.22 mm過濾膜
Acetonitrile
Isooctane
Methanol (Merck, 1.06007.4000)
1. 秤取1 g米麴加入10 mL之acetonitrile中，放入50℃水浴中反應1.5 h。
2. 反應後過濾，並加入10 mL
isooctane萃取去除上層之油酯。
3. 加入等體積之水，並調pH至4.5。
4. 加入10 mL CH3Cl，充分混合後，吸去上層液，並將下層液蒸乾。
5. 以2 mL甲醇回溶，並以0.45 nm濾膜濾去雜質。
0.22 mm過濾膜
1. 將液態培養紅麴成品在4℃下以15,000 rpm離心30 min。
2. 取上清液，通過0.22 mm過濾膜，儲存在4℃下備用。
HPLC測定儀
甲醇溶液
1. 將液態培養液以15,000
rpm在4℃下離心30 min。
2. 以0.22 mm濾膜過濾上清液，儲存於4℃下備用。
3. 分別以5, 10, 20,
30, 40, 50 mg/mL之標準citrinin溶液進行實驗，並作出標準曲線。
4. 取出20 mL通入RP-HPLC管柱
5. 由RP-HPLC圖譜的每一個尖峰 (peak)，可以代表某一物質及其成份的濃度或含量。
◆ 我們以HPLC所產生訊號尖峰的面積 (cm2)，來估計citrinin濃度；以波長220 nm的UV偵測，記錄器的吸光率全幅為0.04。